HPLC法测定玉屏风颗粒中黄芪甲苷及甘露醇的含量

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　　摘要 目的：采用高效液相-蒸發光散射检测（HPLC-ELSD）玉屏风散颗粒中黄芪甲苷和甘露醇的含量，为玉屏风散的质量控制提供实验基础。方法：采用色谱柱出自Waters公司，型号为XBridge-Amide，规格：4.6 mm×150 mm，色谱柱填料颗粒直径3.5 μm;流动相：乙腈（A）-水溶液（B，其中含少量甲醇），流速1 mL/min;梯度洗脱流程见表1;柱温30 ℃;蒸发光检测器：以氮气为载气，流速202.7 kPa，漂移管温度110 ℃，撞击器为“on”。常规对高效液相色谱仪进行方法学的严谨考察，包括专属性试验、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、线性回归试验和加样回收试验。在高效液相色谱仪方法学严谨的前提下，对玉屏风散颗粒进行样品分析研究，并测定其中黄芪甲苷和甘露醇的含量。结果：1）专属性试验结果显示：阴性对照品溶液1在与甘露醇对照品溶液和玉屏分散供试品溶液色谱图相同时间处未见相同色谱峰;阴性对照品2在与黄芪甲苷对照品溶液和供试品溶液色谱图相同时间处未见相同色谱峰。提示甘露醇和黄芪甲苷均具有良好的专属性。2）线性回归结果显示：黄芪甲苷的线性范围为1.1～5.1 mg，其回归方程为：Y=0.732X-4.136（r=0.999 7）;同黄芪甲苷线性回归方法得，甘露醇在1.967～19.674 μg范围内具有良好的线性关系，得到甘露醇回归方程为Y=1.587X+4.983（r=0.999 6）。3）精密度试验结果显示，黄芪甲苷RSD=0.58%，甘露醇RSD=0.36%表明高效液相仪器精密度良好。4）本研究稳定性结果显示黄芩甲苷峰面积的RSD=0.84%，甘露醇峰面积的RSD=0.70%，符合色谱峰相对峰面积的RSD<3%则说明稳定性良好，提示玉屏风散供试品溶液24 h内稳定性良好。5）本研究结果显示色谱峰相对峰面积RSD平均值1.76%，各色谱峰相对峰面积的RSD<3%表示重复性良好，提示玉屏风散供试品溶液的重复性良好。6）结果显示黄芪甲苷对照品溶液、甘露醇对照品溶液平均回收率分别为100.608%、103.487%，RSD分别为0.93%、0.47%，提示高相液相检测方法所测加样回收率结果可靠。7）3个不同批次的玉屏风散中黄芪甲苷成分和甘露醇成分的含量未见明显差异，黄芪甲苷和甘露醇含量平均值分别为0.961 mg/g和0.099 mg/g。结论：高效液相-蒸发光散射检测方法操作简便准确，重复性和稳定性均良好，可作为测定玉屏风散颗粒中黄芪甲苷和甘露醇含量的测定方法。
　　关键词 高效液相;蒸发光散射检测;玉屏风散;黄芪甲苷;甘露醇;含量测定;专属性;重复性
　　Determination of Contents of Astragaloside and Mannitol in Yupingfeng Granules by HPLC
　　Gu Hua，Ding Xiaoliang，Sun Baojun
　　（Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Zhengzhou 450006，China）
　　Abstract Objective：To determine the contents of astragaloside A and mannitol in Yupingfeng powder granules by high performance liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering （HPLC-ELSD），and to provide experimental basis for the quality control of Yupingfeng Powder.Methods：The chromatographic column of XBridge-Amide was produced by Waters Company with specifications of 4.6 mm×150 mm and packing particle diameter of 3.5 um.The mobile phase was acetonitrile （A）-aqueous solution （B，containing a small amount of methanol） with flow rate of 1 mL/min.The gradient elution process was shown in Table 1.Column temperature was 30 C.The evaporative light detector was based on nitrogen.The carrier gas flow rate is 202.7 kPa，the drift tube temperature was 110 degrees，and the impactor was “on”.Routine rigorous methodological investigation of high performance liquid chromatography （HPLC） instrument included specificity test，precision test，stability test，repeatability test，linear regression test and sample addition recovery test.On the premise of rigorous methodology of high performance liquid chromatography，Yupingfeng Powder granules were analyzed，and the contents of astragaloside A and mannitol were determined.Results：1） Specific test results showed that the negative reference solution 1 did not have the same chromatographic peak at the same time as mannitol reference solution and Yuping Powder sample solution chromatogram; the negative reference solution 2 did not have the same chromatographic peak at the same time as astragaloside reference solution and sample solution chromatogram.It was suggested that mannitol and astragaloside had good specificity.2） The linear regression results showed that the linear range of astragaloside A was 1.1-5.1 mg，and the regression equation was Y=0.732X-4.136 （r=0.9997）.The linear regression method with astragaloside A showed that mannitol had a good linear relationship in the range of 1.967～19.674 ug，and the regression equation of mannitol was Y=1.587X+4.983 （r=0.999 6）.3） The precision test results showed that astragaloside RSD=0.58%，mannitol RSD=0.36%，indicating that the precision of high performance liquid chromatography instrument was good.4） The results of this study showed that the RSD of baicalin peak area was 0.84%，and that of mannitol peak area was 0.70%.The RSD<3% which accorded with the relative peak area of chromatographic peak indicated that the stability of Yupingfeng Powder solution was good within 24 h.5） The results showed that the average RSD of relative peak area was 1.76%.RSD<3% of relative peak area indicated good repeatability，suggesting that the solution of Yupingfeng Powder had good repeatability.6） The results showed that the average recoveries of astragaloside A reference solution and mannitol reference solution were 100.608% and 103.487% respectively，and RSD were 0.93% and 0.47% respectively，suggesting that the recoveries of samples determined by high-phase liquid chromatography were reliable.7） There was no significant difference in the contents of astragaloside IV and mannitol in 3 batches of Yupingfeng powder.The average contents of astragaloside IV and mannitol were 0.961 mg/g and 0.099 mg/g，respectively.Conclusion：The method is simple，accurate，reproducible and stable.It can be used for the determination of astragaloside A and mannitol in Yupingfeng Powder Granules. 　　Key Words High performance liquid chromatography; Evaporative light scattering detection; Yupingfeng powder; Astragaloside IV; Mannitol; Content determination; Specificity; Repeatability
　　中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.010
　　玉屏风散是中医学中的经典名方，具有益气固表的作用，在临床上常用于表虚自汗者。全方最早见于《世医得效方》，又有一说始见于《丹溪心法》全方由黄芪、白术、防风等3味中药所组成，用药精简，疗效显著[1]。历代医家对其药物的组成和功效均进行了大量的研究，现代药理学表明[2-4]，在玉屏风散中提取主要具有抗病毒及增强免疫力功效的有效苷类活性成分。同时在对玉屏风散复方中单味药材进行HPLC指纹图谱研究中表明[5-6]，玉屏风散复方中的君药黄芪的主要活性成分为黄芪甲苷。防风则为玉屏风散复方的主要配伍药物之一，对全方的药性有着重大的意义，古语有云：“黄芪得防风，则固表不留邪，防风得黄芪，则祛邪不伤正”，防风中的有效药物成分包含挥发油、β-谷甾醇、以及甘露醇等，通常对黄芪甲苷及甘露醇等成分[7]，通常运用HPLC对复方中的药物成分含量测定方法有HPLC-ELSD（高效液相-蒸发光散射检测）[8]、比色法[9]、薄层扫描法[10]，紫外可见吸收法（UV）[11]等，本研究选择采用HPLC-ELSD法对中的黄芪甲苷及甘露醇含量进行测定，以期从多个成分分析的角度，对玉屏风散复方的相关可靠结果和良好重复性，有助于玉屏风散的质量评价。
　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器 高效液相色谱仪（型号：Prominence LC-20A，产地：日本岛津），系统控制器（型号：系统控制器Prominence CBM-20Alite，产地：日本岛津），梯度系统（型号：LC-20AT，规格：高压GE，产地：日本岛津）;型蒸发光散射检测器（ELSD，型号：SEDEX-55，产地：法国）;购买于北京盛博协同科技有限责任公司的电子分析天平（型号：SB-C1003）;购买于深圳市洁盟清洗设备有限公司超声波清洗器（型号：JP-100plus）;购买于法国MILIPORE公司的超纯水系统（型号：Mili-RO Plus型）。
　　1.2 试药 对照品：黄芪甲苷（纯度为99%以上，批号：110781-200608），甘露醇（纯度为99%以上，批号：100533-201002），购自中国药品生物制品检定所。于上海星可生化有限公司购买的色谱纯乙腈（批号：20110012），于美国Fisher公司购买甲醇（批号：101437）。
　　1.3 分析样品 玉屏风散（云南白药集团股份有限公司，国药准字Z53021556），批次号分别为：1080429、1080507、1080613。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件 采用色谱柱出自Waters公司，型号为XBridge-Amide，规格：4.6 mm×150 mm，色谱柱填料颗粒直径3.5 μm;流动相：乙腈（A）-水溶液（B，其中含少量甲醇），流速1 mL/min;梯度洗脱流程见表1;柱温30 ℃;蒸发光检测器：以氮气为载气，流速202.7 kPa，漂移管温度110 ℃，撞击器为“on”。
　　2.2 对照品溶液配制 精密称取适量黄芪甲苷对照品置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成1.563 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液。精密称取适量甘露醇对照品，加水制成0.3 mg/mL的溶液，作为甘露醇对照品溶液。取适量黄芪甲苷对照品溶液和甘露醇对照品溶液，充分混合均匀，即得混合对照品溶液。
　　2.3 供试品溶液配制 取2.5 g玉屏风散样品粉末精密称定后，采用3号筛过筛后，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，塞上软木塞密封后，称定重量，超声处理30 min，超声时设置参数为250 W和40 kHz;打开软木塞放至室温进行充分冷却后，塞上软木塞再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，采用3 000 r/min进行高速离心3 min，并用0.45 μm的微孔滤膜，即得玉屏风散供试品溶液。阴性对照品溶液1，玉屏风散去防风后同供试品溶液提取方法即得;阴性对照品溶液2，玉屏风散去黄芪后同供试品溶液提取方法即得。
　　2.4 专属性试验 取10 μL甘露醇对照品溶液、黄芪甲苷对照品溶液、玉屏风散供试品溶液和各自对应的阴性对照品溶液，根据2.1的色谱条件进行专属性试验，结果显示阴性对照品溶液1在与甘露醇对照品溶液和玉屏分散供试品溶液色谱图相同时间处未见相同色谱峰;阴性对照品2在与黄芪甲苷对照品溶液和供试品溶液色谱图相同时间处未见相同色谱峰。提示甘露醇和黄芪甲苷均具有良好的专属性。见图1。
　　2.5 线性关系考察
　　精密吸取甘露醇对照品溶液和黄芪甲苷对照品溶液，分别精密吸取上述对照品溶液5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 μL，注入液相色譜仪中，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积的自然对数（l g Y）为纵坐标，以浓度的自然对数（l g X）为横坐标，线性回归，结果显示：黄芪甲苷的线性范围为1.1～5.1 mg，其回归方程为：Y=0.732X-4.136（r=0.999 7）;同黄芪甲苷线性回归方法得，甘露醇在1.967～19.674 μg范围内具有良好的线性关系，得到甘露醇回归方程为Y=1.587X+4.983（r=0.999 6）。 　　2.6 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，在一组相同的测量程序、相同测试地点和相同的色谱条件等情况下，单次进样量为10 μL，连续进样6次，计算黄芪甲苷和甘露醇的峰面积相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）值，并取6次RSD的平均值记为结果。结果显示，黄芪甲苷RSD=0.58%，甘露醇RSD=0.36%表明高效液相仪器精密度良好。
　　2.7 稳定性试验 由于固定相的有限稳定性，为确保每一次研究之间的结果误差最小，取同一批号（1080429）玉屏风散供试品溶液进行稳定性试验，分别将同一批号的玉屏风散供试品溶液室温放置0、4、8、12、24 h后进行HPLC检测，本研究稳定性结果显示黄芩甲苷峰面积的RSD=0.84%，甘露醇峰面积的RSD=0.70%，符合色谱峰相对峰面积的RSD<3%则说明稳定性良好，提示玉屏风散供试品溶液24 h内稳定性良好。见表2、表3。
　　2.8 重复性试验 为确保研究的客观性，需要进行短时间内的HPLC连续重复性测试，精密量取同一批号（1080429）玉屏风散供试品溶液，进样量10 μL，连续进样，本研究结果显示色谱峰相对峰面积RSD平均值1.76%，各色谱峰相对峰面积的RSD<3%表示重复性良好，提示玉屏风散供试品溶液的重复性良好。具体详见表4。
　　2.9 回收率试验 精密吸取已知含量的玉屏风散供试品溶液6份，每份均为1 mL，分别置于10 mL容量瓶中，每一份均精密加入等量已知濃度的0.405 3 mg/mL黄芪甲苷对照品溶液、0.217 3 mg/mL甘露醇对照品溶液，加入超纯水稀释至刻度定容混合均匀后，进行加样回收试验的检测，根据2.1的色谱条件进行检测并计算加样回收率。
　　结果显示黄芪甲苷对照品溶液、甘露醇对照品溶液平均回收率分别为100.608%、103.487%，RSD分别为0.93%、0.47%，提示高相液相检测方法所测加样回收率结果可靠。见表5。
　　2.10 样品检测结果 取1080429、1080507、1080613等3个不同批次号的玉屏风散，根据2.2供试品溶液配制，每批样品都根据2.1的色谱条件进行重复测试3次，玉屏风散中成分的含量取3次测定的平均值，结果显示如表5所示，3个不同批次的玉屏风散中黄芪甲苷成分和甘露醇成分的含量未见明显差异，黄芪甲苷和甘露醇含量平均值分别为0.961 mg/g和0.099 mg/g。见表6。
　　3 讨论
　　本研究中检测玉屏风散中黄芪甲苷和甘露醇的成分含量，而高效液相（HPLC）常规的检测器多有紫外可见吸收检测器（Ultraviolet-visibledetector，UVD）、光电二极管阵列检测器（Photo-diode Array Detector，PDAD）、荧光检测器（Fluorescence Detector，FD）、电化学检测器（Electrochemical Detect，ED）、化学发光检测器（Chemiluminescence Detector，CD）和蒸发光散射检测器（Evaportive Light Scattering，ELSD），其中紫外可见吸收检测器是最常用的一种[12-13]。而由于玉屏风散中的甘露醇成分本身无紫外吸收，本文采用蒸发光检测器测定了甘露醇的含量，HPLC-ELSD蒸发光散射检测器（Evaportive light Scattering，ELSD）自从上个世纪八十年代问世以来，已经广泛的应用在各种实验室检测中，如超临界色谱、逆流色谱以及高效液相色谱。ELSD较之其他方法最为优越的性能在于可以在没有标准品和未知参数的情况下对未知的、不含发色团的化合物进行检测，且检测的化合物种类较多，如碳水化合物、聚合物、脂类、脂肪酸、氨基酸、药物等[14-15]。故而ELSD较之传统的HPLC检测法可不对样品的光学特性进行依赖，同时对于低于流动相的任意挥发性样品均可被检测到，且检测方法独特，仅需1）惰性气体对脱洗液雾化[16];2）在加热管中对流动相进行蒸发[17];3）对样品颗粒进行散射光后即可得到检测结果。
　　在本研究中采用的HPLC-ELSD研究玉屏风散中黄芪甲苷和甘露醇成分含量的过程中，在柱温的选择方面：严格按照供试品溶液的制备方法，在精密称取样品的玉屏分散粉末制备成的玉屏风散供试品溶液，按选定的色谱条件，分别在漂移管温度为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、65 ℃及70 ℃时加样检测，结果显示在温度分别为30 ℃时，峰面积出现最明显且最清晰，而在40 ℃、50 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃时等柱温的变化对检测的结果不存在显著的影响。在色谱柱的选择方面，严格按照玉屏风散供试品溶液的制备方法，在精密称取样品的粉末后将其制备成的玉屏风散供试品溶液，按选定的色谱条件，分别使用2种不同品牌的色谱柱进行加样测定，结果表明，Waters公司和Agilent公司在分别使用了2种色谱柱进行检测的样品，分离均十分良好，所检测出黄芪甲苷及甘露醇的含量均无明显的差异，而考虑到课题经费的因素，选择Waters公司的。在ELSD检测器的条件设置方面，试验通过对影响信号响应的载气流速和漂移管温度进行了优选，结果表明漂移管温度90 ℃气体流速1.0 L/min为最佳条件。试验过程中对玉屏风散供试品溶液的处理方法进行了考察：通过对不同溶剂，不同提取方法和提取时间进行比较试验最终确定，在玉屏风散供试品溶液的制备提取中，用加甲醇超声提取为最佳方法，可以获得含量和峰面积较好的黄芪甲苷和甘露醇，且黄芪甲苷和甘露醇的分离度都很好，没有杂质。
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