HPLC同时测定何首乌中5种成分及指纹图谱的建立

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　　 摘要：目的  建立HPLC同时测定不同产地何首乌中5种指标性成分含量的方法，并建立何首乌HPLC指纹图谱分析方法。方法  采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，测定何首乌样品中五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚含量，用SPSS19.0统计软件对数据进行聚类分析，建立何首乌HPLC指纹图谱并进行分析。结果  何首乌中5种指标性成分的进样量在线性范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999 4。安徽阜阳样品中五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素甲醚含量最高（分别为0.048 9%、0.036 1%、3.179 9%、0.551 2%），贵州安顺样品中大黄素含量最高（0.423 8%）;安徽阜阳样品中指标成分平均总含量最高（3.966 6%），其次为安徽亳州（2.769 8%）、贵州（2.469 4%）及四川（2.306 3%）。云南何首乌样品与其他产地的指纹图谱差异较大，且二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚成分未检出。14批样品指纹图谱有18个共有峰，指认了2、4、7、17、18号峰分别为五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚。结论  本试验建立的方法稳定可靠，重现性好，能有效用于何首乌的质量控制。
　　 关键词：何首乌;含量测定;指纹图谱;聚类分析
　　 中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）06-0075-07
　　 Abstract： Objective To establish an HPLC method to determine the contents of five kinds of index components in Polygoni Multiflori Radix from different producing areas; To establish HPLC fingerprint analysis method of Polygoni Multiflori Radix. Methods Agilent Eclipse XDB-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used， with acetonitrile - 0.1% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase， gradient elution， to determine the contents of galloyl glucose， gallic acid， stilbene glycoside， emodin， and emodin methyl ether in Polygoni Multiflori Radix， and SPSS19.0 software was used to conduct clustering analysis for the data. HPLC fingerprints of Polygoni Multiflori Radix were established and analyzed. Results The injection volume of five index components of Polygoni Multiflori Radix showed a good linear relationship with the peak area integral value in the linear range， and the correlation coefficient were all higher than 0.999 4. The results of the content determination showed that the contents of galloyl glucose， gallic acid， stilbene glycoside， and emodin methyl ether in Polygoni Multiflori Radix from Fuyang， Anhui Province was the highest （0.048 9%， 0.036 1%， 3.179 9%， 0.551 2%， respectively）， and the content of emodin of Polygoni Multiflori Radix from Anshun， Guizhou Province was the highest （0.423 8%）. The average total content of index components of sample from Fuyang， Anhui Province was the highest （3.966 6%）， followed by samples from Bozhou， Anhui Province （2.769 8%）， Guizhou Province （2.469 4%） and Sichuan Province （2.306 3%）. The fingerprints
　　 何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，具有解毒、消癰、截疟、润肠通便功效，用于疮痈、风疹瘙痒、久疟体虚、肠燥便秘等[1]。目前市售何首乌存在伪品、掺伪、染色等问题，影响何首乌的临床应用[2]，因此，制定相应的质量控制标准十分关键。何首乌主要含有二苯乙烯苷类、蒽醌类等化合物[3-11]。本研究以二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、五没食子酰葡萄糖、没食子酸为指标成分，采用HPLC对不同产地的何首乌样品进行含量测定，比较不同产地何首乌之间的差异，并建立HPLC指纹图谱分析方法，为江苏省中医院何首乌药材基地进行标准化、规范化种植与加工提供数据支持，为药监部门对何首乌进行质量监控提供参考方法，并为2020年版《中华人民共和国药典》何首乌质量标准的修订提供参考。 　　1  仪器与试药
　　 Agilent 1260型高效液相色谱仪（G4212B型二极管阵列检测器，G1312B型二元泵，G1367E型高性能自动进样器，G1322A型脱气机，G1316A型柱温箱），BP211D型精密电子分析天平（德国Sartorius公司），OHAUS AX224ZH/E型电子分析天平（苏州赛恩斯仪器有限公司），KQ-6200H型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
　　 没食子酸（批号141109）、2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷（二苯乙烯苷，批号16081506）、大黄素（批号151008）、大黄素甲醚（批号17022010），成都普菲德生物技术有限公司有限公司，纯度≥98%;1，2，3，4，6-O-五没食子酰葡萄糖（五没食子酰葡萄糖，批号lw16041905，纯度≥98%），南京良玮生物科技有限公司;大黄酚（批号c1724029）、芦荟大黄素（批号380041）、大黄酸（批号951089），北京百灵威科技有限公司，纯度≥98%。甲醇、乙腈为色谱纯，德国默克试剂有限公司;水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
　　 何首乌样品由安徽井泉中药饮片有限公司、安徽万生中药饮片有限公司、贵州同德药业中药饮片有限公司、安徽协和成药业中药饮片有限公司帮助收集，经南京中医药大学附属医院朱育凤主任中药师鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，见表1。
　　2  方法与结果
　　2.1  指标成分含量测定
　　2.1.1  色譜条件
　　 色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液;按表2程序进行梯度洗脱;流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;检测波长：254 nm;进样量：20 μL。
　　2.1.2  混合对照品溶液的制备
　　 分别取适量没食子酸、五没食子酰葡萄糖、大黄素、二苯乙烯苷（避光）、大黄素甲醚对照品，加适量甲醇溶解，制成浓度分别为1.26、1.91、1.98、5.21、1.96 mg/mL的对照品贮备液。
　　2.1.3  供试品溶液的制备
　　 取何首乌细粉（过80目筛）约2.0 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入90%甲醇溶液25 mL，称定质量，超声提取（功率280 W，频率50 Hz）45 min，放冷，称重，补足减失的质量，过滤，取续滤液，过0.20 μm微孔滤膜，即得。
　　2.1.4  线性关系考察
　　 取“2.1.2”项下对照品贮备液适量，混合后，等比逐级稀释，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以峰面积积分值为纵坐标，浓度（μg/mL）为横坐标，进行线性回归，计算回归方程，结果见表3。各成分相关系数均大于0.999 4，在相应的范围内线性关系良好。
　　2.1.5  精密度试验
　　 精密吸取“2.1.2”项下对照品贮备液适量，混合后，按“2.1.1”项下色谱条件，连续进样6次，每次20 μL，记录色谱图。以峰面积计，五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的RSD分别为2.48%、4.75%、4.31%、1.59%、0.63%，表明仪器精密度良好。
　　2.1.6  稳定性试验
　　 精密称取9号样品2.0 g，按“2.1.3”项下方法处理，避光、室温放置，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样分析，以峰面积计，五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的RSD分别为3.71%、4.26%、1.99%、0.34%、0.43%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
　　2.1.7  重复性试验
　　 精密称取9号样品6份，按“2.1.3”项下方法制备，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以峰面积计，五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚RSD分别为3.66%、4.71%、2.00%、0.60%、0.35%，表明本方法重复性良好。
　　2.1.8  加样回收率试验
　　 精密称取9号样品1.0 g，共6份，加入五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行分析，测得各成分平均加样回收率分别为101.46%、103.64%、103.64%、96.52%、100.45%，RSD分别为0.55%、0.18%、0.42%、0.55%、0.89%，见表4。
　　2.1.9  样品含量测定
　　 取16批何首乌样品各约2.0 g，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算指标成分含量，结果见表5，色谱图见图1。
　　2.2  不同产地何首乌聚类分析
　　 采用SPSS19.0软件进行系统聚类分析，以4个不同省份何首乌样品中的5种指标成分为研究对象。将原始数据经标准化变换后，采用平方Euclidean距离法计算样品间的相似性，选用组间距离法进行聚类，结果见图2。可以看出，云南何首乌样品距离最远，其次为安徽样品，四川与贵州样品聚为一类。
　　2.3  何首乌指纹图谱的建立
　　2.3.1  样品来源
　　2.3.2  色谱条件
　　2.3.3  供试品溶液的制备 　　2.3.4  参照峰的选择
　　2.3.5  精密度试验
　　 取何首乌样品（S9）2.0 g，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，避光、室温放置，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱峰面积，以二苯乙烯苷为参照峰计算各共有峰的相对峰面积，其RSD均小于4.36%。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行分析，各样品色谱图之间的相似度为1，符合指纹图谱技术要求。
　　2.3.6  稳定性试验
　　 取何首乌样品（S9）2.0 g，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，避光、室温放置，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，记录色谱峰面积，计算各共有峰的相对峰面积，其RSD均小于4.71%。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件进行分析，各样品色谱图之间的相似度为1，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
　　2.3.7  指纹图谱建立及相似度评价
　　 取14批何首乌样品粉末，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件进行分析。以S1样品图谱作为参照图谱，采用多点校正方法匹配色谱图，通过中位数法生成对照图谱，共确定了18个共有峰。采用对照品对照，确定了2、4、7、17、18号峰分别为五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚（见图3、图4）。采用中位数法导出14份样品的共有模式与相似度评价（见表7、表8）。14份样品中有11份相似度大于0.90，质量相对稳定;其中S9、S10、S12相似度低于0.90，质量稍差。
　　4  讨论
　　 在流动相选择上，本试验比较了甲醇-水与乙腈-0.1%磷酸水溶液[5]，结果当流动性为乙腈-0.1%磷酸水溶液时，各成分峰形及分离度较好，故选用乙腈- 0.1 %磷酸水溶液作为流动相。
　　 在供试品溶液制备中，本试验比较了70%、80%、90%、100%甲醇作为提取溶剂在相同环境条件下的提取效果，通过进样分析，比较各成分的峰面积，发现90%甲醇作为提取溶剂时效果最佳，故选用90%甲醇作为提取溶剂。
　　 由指标成分含量测定结果可知，何首乌主要含有二苯乙烯苷类、蒽醌类，其中，蒽醌类化合物主要为大黄素和大黄素甲醚，而大黄酸、大黄酚和芦荟大黄素含量极低甚至难以测出;此外，何首乌中还含有少量五没食子酰葡萄糖、没食子酸。由表5可知，贵州、安徽、四川产地的何首乌样品中的二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚含量均符合2015年版《中华人民共和国药典》规定;云南产地何首乌样品中未检测出二苯乙烯苷类及蒽醌类成分，不符合药典规定。由图1、图2可以看出，云南产地何首乌样品峰形与其他产地的何首乌样品存在显著差异，推测云南产地的何首乌可能是其同属近源物种。安徽阜阳的何首乌样品中五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷及大黄素甲醚的含量最高（分别为0.048 9%、0.036 1%、3.179 9%、0.551 2%）;贵州的何首乌样品中大黄素含量最高（0.423 8%）。指标性成分平均总含量最高的为安徽阜阳样品（3.966 6%），其次为安徽亳州、贵州、四川样品（2.769 8%、2.469 4%、2.306 3%）。聚类分析结果表明，不同产地何首乌之间有一定差异，云南产何首乌与其他产地样品差异显著，与含量测定结果相符;安徽产何首乌与四川、贵州样品差异也较大，四川与贵州样品接近，可归为一类，这与各地区地理位置存在一定相关性。
　　 本试验建立了何首乌HPLC指纹图谱，确定了18个共有峰，指认了何首乌中的五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚5个化学成分。通过使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件分析，14批样品中有11批相似度>0.90，S9、S10、S12相似度<0.90，表明大部分何首乌样品质量较稳定，少数样品质量有待提高。指纹图谱的建立有助于优化何首乌的质量控制方法，可应用于何首乌的质量检测。
　　 综上所述，本试验测定了16批不同产地的何首乌样品中五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚5种指标性成分的含量，通过使用SPSS19.0软件进行聚类分析，发现云南产何首乌样品为同属近源种，不能作为何首乌药材使用，且何首乌指标成分含量的分布具有一定地域性。本试验采用贵州、四川、安徽何首乌样品建立了何首乌HPLC指纹图谱，确定了18个共有峰，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价》软件分析发现，14批样品中有3批样品质量稍差。本研究建立的指纹图谱能够较全面反映何首乌的整体情况。将指标成分含量测定结果与指纹图谱结合，能较完整地体现何首乌的质量。方法学考察结果表明，本方法稳定、可靠，重现性好，可作为何首乌质量控制的检测方法之一。本研究可为何首烏的质量控制及2020年版《中华人民共和国药典》何首乌质量标准的修订提供参考依据。
　　参考文献：
　　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：175-177.
　　[2] 朱育凤，吴旭彤，蒲维亚，等.影响中药饮片质量的因素及其对策[J].中医药管理杂志，2010，18（3）：252-254.
　　[3] 李建平.何首乌药理作用研究近况[J].中国药业，2003，12（10）：74-75.
　　[4] 李学林，张帆，唐进法，等.何首乌炮制品有效成分与抗衰老功效的相关性研究[J].中国新药杂志，2018，27（9）：76-89.
　　[5] 彭贵龙，周光明，杨远高，等.高效液相色谱同时测定何首乌中大黄酸、大黄素和大黄酚的含量[J].四川大学学报（自然科学版），2014，51（2）：349-353.
　　[6] 崔红花，赵英日，王淑美.大黄蒽醌类成分的提取方法筛选及均匀设计优化工艺研究[J].中国药房，2010，21（7）：612-614.
　　[7] 郭青，鲁静.高效液相色谱法测定何首乌及其炮制品中蒽醌类成分的含量[J].药物分析杂志，2000，20（5）：326-328.
　　[8] 赵荣华，赵声兰，文丹，等.何首乌不同部位二苯乙烯苷含量测定[J].云南中医学院学报，2008，31（1）：7-9.
　　[9] 李帅锋，郑传柱，张丽，等.不同产地何首乌HPLC指纹图谱研究[J].中草药，2015，46（14）：2149-2154.
　　[10] 楼招欢，吕圭源，俞静静.何首乌成分、药理及毒副作用相关的研究进展[J].浙江中医药大学学报，2014，38（4）：495-500.
　　[11] 刘美廷，李倩，屈敏红，等.何首乌与制何首乌的高效薄层色谱指纹图谱研究[J].华西药学杂志，2018，33（2）：193-196.
　　[12] 黄世琼，张毅，杨军宣.何首乌主要成分二苯乙烯苷的研究进展[J].海峡药学，2016，28（6）：37-39.
　　（收稿日期：2018-08-02）
　　（修回日期：2018-08-29;编辑：陈静）
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