HPLC测定四川梓潼产葛根和粉葛中四种异黄酮含量的分析

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　　摘要：采用YMC-Pack ODS-A C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）测定四川梓潼产葛根和粉葛中4种异黄酮（葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元）含量。结果测得葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的线性范围分别为0.050～0.750、0.010～0.150、0.010～0.150和0.012～0.180 μg，线性关系良好（r>0.999），平均加样回收率为96.52%～100.22%，RSD为0.75%～1.84%。该方法简便、准确、重现性好，适用于葛根中异黄酮含量的测定。梓潼产葛根中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量明显高于粉葛，且梓潼产葛根和粉葛中大豆苷元含量明显高于其他产地的葛根和粉葛。
　　关键词：葛根;粉葛;高效液相;异黄酮;含量
　　中图分类号：O657.7+2         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）09-0114-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.027           開放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： To determine the contents of four isoflavones of Pueraria lobata and Pueraria thomsonii in Sichuan Zitong by HPLC. The chromatographic conditions were YMC-Pack ODS-A C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）. The linear range of puerarin， 3′-methoxy puerarin， daidzin and daidzein were 0.050～0.750， 0.010～0.150， 0.010～0.150 and 0.012～0.180 μg， respectively， and it showed a good linear relationship（r>0.999）， the average recovery rate was between 96.52%～100.22%， and RSD was between 0.75%～1.84%（n=6）. This method is simple， accurate and reproducible. It is suitable for the determination of isoflavones in Puerarin. The contents of 4 isoflavones of P. lobata are obviously higher than P. thomsonii from Zitong， Sichuan Province. And the content of daidzein in P. lobata and P. thomsonii from Zitong is obviously higher than other habitat origins reported.
　　Key words： Pueraria lobata; Pueraria thomsonii; HPLC; isoflavone; content
　　葛根和粉葛分别来源于豆科葛属植物野葛[Pueraria lobata （Willd.） Ohwi]和甘葛藤[Pueraria thomsonii Benth]的干燥根[1]，味甘、辛、凉，归脾、胃经，具有解表退热、生津、透疹、升阳止泻之功效[1-3]，均含有葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类活性成分，但由于基源不同，两者所含活性物质的量存在一定差别[4-6]，《中华人民共和国药典》从2005年版开始也将葛根和粉葛作为两个品种分开[7-9]。
　　葛根和粉葛在四川分布广泛，梓潼县为“5.12”地震受灾区，灾后重建过程中当地药农在政府帮扶和支持下大量种植葛根和粉葛，但其主要药效成分的含量未见报道。本研究采用HPLC法，以葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元为指标，对梓潼产葛根和粉葛药材进行了质量评价，为当地两种药材的品质评价和资源利用提供参考。
　　1  材料与方法
　　1.1   材料
　　试验所用葛根和粉葛药材于2016年12月采自四川梓潼县富库葛根专业合作社种植基地，经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科副教授鉴定为豆科植物野葛和甘葛藤的干燥根。
　　1.2  仪器与试药
　　Agilent 1260 Infinity Series高效液相色谱仪;XY-200型高速多功能粉碎机（浙江省永康市松青五金厂）;BSA124S电子天平，十万分之一（德国赛多利斯集团）;SK7200LH超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）;UPR-11-10T超纯水器。
　　葛根素（批号为110752-200912）、大豆苷（批号为111738-200501）、大豆苷元（批号为111502-200402）对照品购于中国食品药品检定研究院;3′-甲氧基葛根素（批号为MUST-13092410）对照品购于成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇为色谱纯，水为超纯水（自制）。
　　1.3  方法
　　1.3.1  供试品溶液的制备  精密称取梓潼葛根和粉葛粉末（过3号筛）0.1 g，置于圆底烧瓶中，精密加入50 mL 30%乙醇，称定质量，超声处理1 h，放冷，再称定质量，用30%乙醇补足失重，摇匀，0.45 μm微孔膜过滤，取续滤液，即得。 　　1.3.2  混合对照品溶液的制备  分别精密称取葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元对照品适量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀。精密移取0.5 mL，置于5 mL量瓶中，甲醇定容，使其质量浓度分别为50.00、10.00、10.00、12.00 μg/mL，保存于4 ℃冰箱中，备用。
　　1.3.3  色谱条件  YMC-Pack ODS-A C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相水（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～10 min，25% B;10～35 min，25%～44% B;35～40 min，44%～49% B;40～45 min，49%～60% B;45～55 min，60%～25% B）;流速1.0 mL/min;柱温22 ℃;检测波长254 nm;进样量10 μL。
　　2  结果与分析
　　2.1  HPLC色谱
　　HPLC色谱见图1。
　　2.2  线性关系考察
　　吸取“1.3.2”项下混合对照品溶液1、2、6、10、 15 μL，在“1.3.3”色谱条件下进样，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标进行线性回归[10]，结果见表1。
　　2.3  精密度试验
　　精密吸取“1.3.2”项下混合对照品溶液10 μL，連续进样6次，测得葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元峰面积RSD分别为1.77%、2.06%、1.44%、1.50%，表明仪器精密度良好。
　　2.4  稳定性试验
　　取同一供试品适量，按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“1.3.3”项色谱条件下测定，记录色谱图，测得葛根的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元峰面积RSD分别为1.28%、1.64%、1.68%、0.55%;粉葛的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元峰面积RSD分别为2.09%、1.77%、1.06%、0.62%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
　　2.5  重复性试验
　　取葛根和粉葛药材各3份，精密称定，按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，在“1.3.3”项色谱条件下测定，记录色谱图，测得葛根的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元含有量RSD分别为0.85%、0.56%、1.93%、0.40%;粉葛的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元含有量RSD分别为1.31%、1.35%、1.37%、0.70%，表明该方法重复性良好。
　　2.6  加样回收试验
　　精密称取葛根和粉葛药材各3份，每份0.06 g，精密加入葛根素（1.98 mg/mL）对照品溶液2 mL、3′-甲氧基葛根素（0.10 mg/mL）对照品溶液1 mL、大豆苷（0.20 mg/mL）对照品溶液1 mL、大豆苷元（0.13 mg/mL）对照品溶液1 mL，按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，计算加样回收率。结果见表2。
　　2.7  样品含量测定
　　称取梓潼产葛根和粉葛各3份，按“1.3.1”的方法制备供试品溶液，在“1.3.3”色谱条件下测定，结果见表3。由表3可知，梓潼产葛根中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量明显高于粉葛中的含量，说明梓潼产葛根的品质优于粉葛。
　　3  讨论
　　葛根和粉葛在中国南方地区分布广泛，其中葛根是著名的药食同源药材。试验采用甲醇-水溶液梯度洗脱法，能使葛根和粉葛中的几类主要异黄酮化合物得到较好的分离。四川梓潼产葛根中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量明显高于粉葛中的含量，说明梓潼产葛根的品质优于粉葛;梓潼产葛根和粉葛中大豆苷元的含量明显高于文献报道的其他产地的葛根和粉葛[10-12]，可为四川梓潼产葛根和粉葛的品质评价及开发利用提供参考依据。
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　　收稿日期：2018-10-23
　　基金项目：国家重大科技专项（2013ZX09103002-014）;2017年中医药公共卫生服务补助专项[财社（2017）66号];四川省中医药管理局中医药科学技术研究专项（2016Q037）;大学生科研训练计划项目（2017093;201710613067）;第12期大学生个性化实验项目（GX201812098）
　　作者简介：徐炜锋（1996-），男，浙江绍兴人，在读本科生，制药工程专业，（电话）17713550530（电子信箱）524417896@qq.com;通信作者，蒋合众（1980-），男，重庆铜梁人，副教授，博士，主要从事天然药物化学研究，（电子信箱）jianghz10@sina.com。
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