广东省15个不同产地五指毛桃药材中补骨脂素含量测定
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摘 要：目的 建立五指毛桃药材中补骨脂素的高效液相色谱测定方法，测定广东省15个不同产地五指毛桃药材中补骨脂素含量，了解广东省不同产地五指毛桃药材质量情况。方法 采用反相高效液相色谱法测定补骨脂素的含量，Waters C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-水（60∶40），流速为1.0mL/min，柱温：35℃;检测波长：245nm。结果 补骨脂素在9.4～198.5?g/mL范围内，线性关系良好，平均回收率为99.94%，RSD为0.64%。广东省不同产地五指毛桃的补骨脂素含量范围为0.165～1.187mg/g，说明广东省不同产地五指毛桃质量较好。结论 五指毛桃药材中补骨脂素的HPLC分析方法结果准确，重现性好，可作为五指毛桃药材的质量评价方法。
关键词：五指毛桃 补骨脂素 含量测定
中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2019）02（c）-0201-02
五指毛桃為岭南常用草药、煲汤材料，俗称牛奶木、五指龙、土黄芪，以桑科榕属植物粗叶榕（Ficus hirta Vahl）的根入药，性平，味甘、辛，具有益气健脾、祛痰化湿、舒筋活络的作用，用于肺虚痰喘、脾胃气虚、肢倦无力[1]，主要分布于广东、广西、福建、海南、贵州、云南等地，以广东河源人工种植面积最广，其中河源已经建立起多个五指毛桃的GAP种植基地，为五指毛桃的规范化种植提供了技术支持。研究表明，五指毛桃主要含有香豆素类[2]、黄酮类[2]、甾体及其他挥发性成分，其中，补骨脂素、佛手内酯在不同产地、不同采收年份、不同采收季节、不同农家类型品种的五指毛桃含量显著较高，可作为五指毛桃内在质量评价和鉴定的依据[3-4]。五指毛桃的质量标准目前收载于《广东省中药材标准 第一册》（2004年版）第35页、《广西壮药品种质量标准（第二卷）》第47页、《湖南省中药材标准（2009年版）》，只有《广西壮药品种质量标准》对五指毛桃做出了补骨脂素的含量测定要求，但其流动相使用了乙腈，毒性较大，成本较高。根据五指毛桃化学成分与药理作用研究，发现补骨脂素是其主要活性成分之一，具有抗菌[5]、镇咳平喘[5]、抗炎镇痛[5]、对急性肝损伤的保护[6-7]、免疫调节[8]等作用。为了分析和评价广东省不同地区五指毛桃的质量，该研究采用高效液相色谱法分别对广东省15个不同地区五指毛桃中补骨脂素的含量进行检测，为制定五指毛桃质量标准提供依据。
1 仪器与试药
戴安U3000高效液相色谱仪;电子分析天平（梅特勒-托利多）;密理博milli-Q Direct 8 纯水仪（美国Millipore公司）;超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;粉碎机（泓荃制药机械公司）;甲醇（色谱纯），补骨脂素对照品购于中国食品药品检定研究院，五指毛桃药材采收于广东省15个不同地区（见表1）。
2 方法与结果
（1）色谱条件。Waters C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相：水-甲醇（40：60），流速为1.0mL/min，进样体积为10μL，柱温：35℃;检测波长：245nm。
（2）对照品溶液的制备。精密称取补骨脂素对照品适量，加甲醇制成每1mL含50.2?g/mL的溶液即得。
（3）供试品溶液的制备。取五指毛桃粗粉0.5g，精密称定，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入10mL甲醇，称定质量，超声（功率100W，频率40kHz）提取30min，冷却至室温后用甲醇补足失质量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
（4）线性关系考察。分别精密称取补骨脂素对照品适量，加甲醇制成浓度为9.4μg/mL、24.6μg/mL、50.2
μg/mL、100.1μg/mL、198.5μg/mL的溶液，分别10μL，按“（1）”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，以浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得补骨脂素标准品回归方程为Y=0.838X+0.116，R2=0.999;线性范围为9.4～198.5μg/mL。
（5）精密度试验。取“（2）”项下对照品溶液10μL，注入液相色谱仪中，测定峰面积，重复测定6次，峰面积分别为42.159、43.106、42.841、41.984、42.562、42.618，RSD为0.98%，表明仪器的精密度良好。
（6）稳定性试验。取第8号样品，按“（3）”项下方法制备供试品溶液，按“（1）”项下色谱条件，分别于0、1、2、3、8、12、24h时测定峰面积，为49.203、50.541、49.956、50.025、50.952、49.991、50.124，RSD为1.08%，结果表明补骨脂素在24h内测定，稳定性良好。
（7）重复性试验。取第8号样品6份，按“（3）”项下方法制备供试品溶液，按“（1）”项下色谱条件进行测定，峰面积为49.203、49.985、50.125、50.518、49.251、50.458，RSD为1.15%，表明该方法重复性良好。
（8）加样回收试验。取已测定补骨脂素含量的第8号五指毛桃样品9份，每份0.3g，其中3份分别精密加入“（2）”项下对照品溶液5mL，另外3份分别精密加入“（2）”项下对照品溶液8mL，剩下3份分别精密加入“（2）”项下对照品溶液10mL，按“（3）”项下方法制备供试品溶液，按“（1）”项下色谱条件，进行测定，分别计算低、中、高浓度组样品的加样回收率和RSD。结果显示，低浓度组平均加样回收率为100.09%，RSD为1.19%;中浓度组平均加样回收率为99.88%，RSD为0.50%;高浓度组平均加样回收率为99.85%，RSD为0.22%，这说明了此方法中补骨脂素的加样回收率良好。
（9）样品测定。分别取五指毛桃粗粉，按“（3）”项下方法每批样品平行制备供试品溶液2份，按“（1）”项下色谱条件进行测定，利用“（4）”项下建立的标准曲线，计算五指毛桃样品中补骨脂素的含量，结果见表1。
3 结论
补骨脂素是五指毛桃的主要活性成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗凝血、抑制肿瘤、免疫调节等作用，该研究发现补骨脂素在五指毛桃中含量较高，稳定性好，可作为制定五指毛桃质量标准的指标性成分。五指毛桃药材中补骨脂素的HPLC分析方法结果准确，重现性好，可作为五指毛桃药材的质量评价方法。
4 讨论
该研究测定了广东省15个不同地区五指毛桃中补骨脂素的含量，发现不同地区的五指毛桃中的补骨脂素含量差别较大，在制定其质量标准时，应加大样本量进行研究，并进一步研究不同生长时期对补骨脂素含量的影响。
参考文献
[1] 广东省中药材标准（第一册）（2004年版）[S].
[2] 轧霁，张晓琦.五指毛桃黄酮和香豆素类成分研究[J].林产化学与工业，2008，28（6）：49-52.
[3] 郑蓉蓉，轧霁.五指毛桃的化学成分研究[J].中国中药杂志，2013，38（21）：3696-3700.
[4] 魏刚，刘春玲，何建雄，等.五指毛桃GC-MS特征指标成分群探讨[J].中医药学刊，2005，23（7）：1249-1251.
[5] 陶敬奇，闻莹莹.五指毛桃指纹图谱的高效液相色谱-质谱联用研究[J].华南师范大学学报：自然科学版，2011，8（3）：78-81.
[6] 周添浓，王艳，唐立海，等.五指毛桃抗炎镇痛及对急性肝损伤的保护作用研究[J].今日药学，2008，18（2）：55-58，1692-1693.
[7] 吕颖坚，贾凤兰，阮明，等.五指毛桃水提物对二甲基甲酰胺所致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中药材，2008，31（9）：1364-1368.
[8] 刘春玲，徐鸿华，吴清和，等.五指毛桃对小鼠免疫功能影响的实验研究[J].中药材，2004，27（5）：367-368.
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