辣椒药材的HPLC指纹图谱建立及聚类分析和主成分分析

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　　摘 要 目的：建立辣椒药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并进行聚类分析和主成分分析。方法：采用HPLC法。色谱柱为Agilent C18，流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为235 nm，柱温为30 ℃，进样量为15 ?L。以辣椒素峰为参照，绘制15批药材样品的HPLC指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）进行相似度评价，确定共有峰，并采用SPSS 19.0软件进行聚类分析和主成分分析。结果：15批药材样品的HPLC图谱相似度均在0.95以上；有12个共有峰，并指认了辣椒素峰；聚类分析结果显示，15批药材样品可聚为3类，S1、S3～S5、S7、S9～S13聚为一类，S2、S14、S15聚为一类，S6、S8聚为一类。经主成分分析，4个主成分因子的累积方差贡献率为94.093%，以S5药材样品的主成分因子综合得分最高、整体质量最好。结论：所建HPLC指纹图谱及聚类分析和主成分分析结果可为辣椒药材的质量控制提供参考。
　　关键词 辣椒；高效液相色谱法；指纹图谱；聚类分析；主成分分析
　　Establishment of HPLC Fingerprint， Cluster Analysis and Principal Component Analysis of Capsicum annuum
　　FENG Hua1，WANG Xiangpei2，WANG Shijun1，ZHENG Huangya1，ZHANG Qiang1（1. TCM Section， Zunyi Institute for Food & Drug Control， Guizhou Zunyi 563002， China； 2. School of Pharmacy， Guiyang College of TCM， Guiyang 550002， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Capsicum annuum，and to conduct cluster analysis and principal component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.2% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 235 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 15 ?L. Using capsaicin peak as reference， HPLC fingerprints of 15 batches of C. annuum from different production areas were determined. The similarity evaluation of common peaks was evaluated by using the TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A edition） to confirm common peaks. Cluster analysis and principal component analysis were performed by using SPSS 19.0 software. RESULTS： The similarities were more than 0.95 in HPLC chromatograms of 15 batches of C. annuum. There were 12 common peaks. Its HPLC fingerprint was in good agreement with that of control fingerprint. 15 batches can be divided into three sub-categories as S1， S3-S5， S7， S9-S13 sub-categorie， S2， S14， S15 sub-categorie and S6， S8 sub-categorie. Through the principal component analysis， the cumulative contribution rate of 4 main component factors was 94.093， and comprehensive score of S5 was the highest with the best quality. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprints， cluster analysis and principal component analysis results can provide reference for the quality control of C. annuum.
　　KEYWORDS Capsicum annuum； HPLC； Fingerprint； Cluster analysis； Principal component analysis
　　辣椒為茄科植物辣椒（Capsicum annuum L.）的干燥成熟果实，被2015年版《中国药典》（一部）和2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载为药材品种[1-2]。辣椒具有温中散寒、开胃消食的功效，可用于治疗寒滞腹痛、呕吐、泻痢、冻疮[1-2]。辣椒素是辣椒中的一种辛辣成分，可通过结合辣椒素受体， 使细胞内钙离子浓度升高， 引起神经元及其纤维释放多种内啡肽， 具有抗炎、镇痛、扩张心血管、抗肿瘤、保护胃黏膜、促进溃疡愈合、抑制幽门螺杆菌等作用[3-4]。目前辣椒的质量控制项目只有性状、显微及薄层鉴别、辣椒素和二氢辣椒素含量测定。其中2015年版《中国药典》（一部）仅对上述两个主成分的含量进行控制，这就难以全面评价其质量。 　　指纹图谱技术是整体表征中药所含成分的一种有效方法，是中药及其制剂质量控制的有效手段之一[3]。辣椒含有辣椒素、二氢辣椒素、降二氢辣椒碱、高辣椒碱、高二氢辣椒碱、辣椒红色素、辣椒玉红素等成分[4]。通过查阅文献发现，目前还未有体现辣椒整体化学信息的研究报道。为此，笔者采用高效液相色谱法（HPLC）建立了15批辣椒药材样品的指纹图谱，并结合聚类分析法进行综合评价，以期为其质量控制提供参考。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　LC-1260型HPLC仪，包括四元泵、二极管阵列检测器、柱温箱、自动进样器、Agilent1260型工作站（美国Agilent 公司）；AB204-S型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-500DV型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；YF-111型中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）。
　　1.2 药品与试剂
　　辣椒素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：1110839-201403，纯度：100%）；甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。
　　1.3 药材
　　15批药材样品均于2017年9月采集于贵州省遵义市，经遵义市食品药品检验所邓顺超副主任药师鉴定为茄科植物辣椒（Capsicum annuum L.）的干燥成熟果实。样品来源见表1。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　色谱柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10%A→20%A；10～20 min，20%A→40%A；20～35 min，40%A→70%A；35～50 min，70%A；50～55 min，70%A→10%A；55～60 min，10%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：235 nm；柱温：30 ℃；进样量：15 ?L[5-8]。
　　2.2 溶液的制备
　　2.2.1 对照品溶液 精密称取辣椒素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含辣椒素0.05 mg的溶液，即得。
　　2.2.2 供试品溶液 取样品粉末（过2号筛）约2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，称定质量，超声（功率：250 w，频率：40 kHz）提取50 min，放至室温，用甲醇补足减失的质量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
　　2.3 方法学考察
　　2.3.1 精密度试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S3）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以辣椒素峰为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，12个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明本方法精密度良好。
　　2.3.2 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S3）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以辣椒素峰为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，12个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n=7），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。
　　2.3.3 重复性试验 取样品粉末（编号：S3）6份，每份约2.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”項下色谱条件进样测定，以辣椒素峰为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，12个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重复性良好。
　　2.4 HPLC指纹图谱生成与相似度、共有峰相关分析
　　2.4.1 HPLC指纹图谱的生成 取15批药材样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对15批药材样品的HPLC指纹图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。
　　2.4.2 相似度分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）对样品进行整体相似度分析。结果显示，15批药材样品的相似度均大于0.95，且与对照指纹图谱具有较好的一致性，表明样品间成分差异较小、质量稳定性良好，详见表2。
　　2.4.3 共有峰的指认及相关分析 15批药材样品共有12个共有峰，通过与对照品HPLC图（见图3）对比，指认出10号峰为辣椒素峰。由于该峰峰面积大，且为所有样品共有，故以其保留时间和峰面积为参照，计算其他峰相对于该成分峰的相对保留时间和相对峰面积，详见表3、表4。
　　2.5 聚类分析
　　以各共有峰的峰面积原始数据为变量，采用SPSS 19.0软件对原始数据进行标准化，以欧氏距离为测度进行聚类分析，详见图4。由图4可知，15批药材样品可聚为3类：S1、S3～S5、S7、S9～S13聚为一类，S2、S14、S15聚为一类，S6、S8聚为一类。
　　2.6 主成分分析
　　2.6.1 主成分因子特征值、方差贡献率分析 采用SPSS 19.0软件进行主成分因子分析，其特征值和方差贡献率详见表5。由表5可知，以特征值>1为标准，得到前4个主成分因子的特征值分别为 56.299、16.826、13.591、7.377，方差贡献率分别为 56.299%、16.826%、13.591%、7.377%，累积方差贡献率为94.093%，表明前4个主成分即可以代表样品94%以上的信息，提示该组数据有突出的成分可作为依据，适用于主成分分析。
　　采用前4个主成分因子为指标对15批药材样品进行评价，详见表6。由表6可知，主成分因子1可反映成分2、3、4、5、6、7、8、10、11、12的信息，主成分因子2可反映成分1、9、12的信息，主成分因子3可反映成分1、6、7的信息，主成分因子4可反映成分1、2、3的信息。 　　2.6.2 综合质量评分 以上述4个主成分因子对15批药材样品质量进行综合评分（综合得分=相应的因子得分×[相应主成分因子的特征值] [√]，综合得分越高表示药材样品整体质量越好[9]），结果见表7。由表 7可知，S5药材样品主成分因子综合得分最高，该批样品中成分2、3、4、5、6、7、8、10、11、12的含量相对较高，整体质量相对较好。
　　3 讨论
　　3.1 指纹图谱相关参数考察
　　笔者通过采用二极管阵列检测器在190～400 nm波长范围内进行紫外全波长扫描，扫描结果发现在225、235、280 nm波长处有最大吸收，其中在235 nm波长处色谱图基线噪音较低，各峰的保留时间适中，分离度较好，基线稳定，有利于指纹图谱分析，考虑兼顾各成分的检测信号强度和检测灵敏度，故选择检测波长为235 nm。笔者通过考察不同浓度甲醇、乙醇为提取溶剂发现，以甲醇提取时的出峰个数较多、峰形好，且基线平整，故选择甲醇为提取溶剂。又通过比较超声、浸渍、回流提取3种不同提取方法对色谱图的影响，结果3种提取方法下所得色谱图没有差异，考虑到超声操作省时、方便，故选择提取方法为超声提取；进一步对30、40、50、60 min等不同提取时间进行考察，结果发现提取50 min后提取效果基本接近，故选择提取時间为50 min。此外通过对甲醇-磷酸、甲醇-水、乙腈-水3个流动相系统（等度洗脱）进行考察，结果各峰分离度均达不到分离要求；进一步选择梯度洗脱后发现，以甲醇-0.2%磷酸水溶液洗脱效果最好，出峰数最多，基线平稳，各峰分离度均达到分离要求[10-11]。
　　3.2 参照峰的选择
　　辣椒主要成分为辣椒素和二氢辣椒素[12]，笔者以辣椒素和二氢辣椒素为参照时发现，辣椒素峰靠中、峰面积大，而二氢辣椒素峰靠后、峰面积相对较小，故通过色谱定位，指认10号峰为辣椒素。
　　3.3 不同产地辣椒药材成分比较
　　笔者通过建立辣椒HPLC指纹图谱，并对15批药材样品进行比较时发现，辣椒对照指纹图谱共有峰保留时间、相对峰面积与各产地辣椒样品非常吻合，15批药材样品相似度均在0.95以上；从15批药材样品指纹图谱12个共有峰可以看出，峰面积大小差异较大，说明不同产地辣椒共有成分虽一致，但含量存在差异，这可能与其生长环境因素有关[13-14]。
　　3.4 辣椒药用情况
　　以往辣椒主要在食品方面研发较多，在药用方面研究较少。其实早在《全国中草药汇编》中已将辣椒纳入药用，而自从辣椒被2010年版《中国药典》（一部）收载为药材品种后，其药用开发开始受到重视。目前有辣椒风湿膏、复方辣椒碱乳膏、辣椒碱乳膏等药字号品种上市。辣椒是遵义市的一项传统优势产业，有近两百多年的种植历史。遵义辣椒1960年被评为全国七大名椒之一，2001年荣获中国农业博览会“名牌产品”[15]。遵义产辣椒品种较多，笔者只针对茄科植物辣椒（C. annuum L.）这个药典品种进行研究，后续拟扩大品种研究范围，以期为遵义辣椒深度开发与应用打下基础。
　　综上所述，本研究所建HPLC指纹图谱、聚类分析、主成分分析结果可为辣椒药材的质量控制提供参考。
　　参考文献
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　　（收稿日期：2018-04-23 修回日期：2019-03-19）
　　（编辑：余庆华）
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