川芎饮片的HPLC指纹图谱建立、聚类分析及偏最小二乘判别分析

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　　摘 要 目的：建立川芎飲片的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并进行聚类分析和偏最小二乘判别（PLS-DA）分析。方法：采用HPLC法，色谱柱为Waters Symmetry C18，流动相为乙腈-0.5%醋酸水溶液（梯度洗脱），流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。以藁本内酯为参照，绘制21批样品（S1～S21）的HPLC图谱；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 A版）进行相似度评价，确定共有峰；采用SPSS 19.0软件进行聚类分析，并结合PLS-DA分析区分样品。结果：21批样品的HPLC图谱有25个共有峰，并指认了其中9个共有峰；相似度为0.769～0.989，其中基地、传统药用部位样品（S1～S10）相似度均大于0.970。21批样品可聚为3类，S1～S10聚为一类，S15～S16、S19～S20聚为一类，其余聚为一类。PLS-DA分析确定了11个分类标志物，并指认了阿魏酸、阿魏酸松柏酯、正丁基苯酞、藁本内酯、洋川芎内酯A等5个色谱峰，这5个色谱峰可有效区分非市售、基地样品（S1～S10）与市售、非基地样品（S11～S21），与聚类分析结果一致。结论：所建指纹图谱、聚类分析及PLS-DA分析结果可为川芎饮片的质量评价提供参考。
　　关键词 川芎；高效液相色谱法；指纹图谱；聚类分析；偏最小二乘判别分析
　　Establishment of HPLC Fingerprint， Cluster Analysis and PLS-DA of Ligusticum chuanxiong Decoction Pieces
　　SHI Haipei1，BAO Beihua1，HUANG Shengliang2，WANG Guoqiang2，ZUO Wupeng2，YAN Hui1，3，ZHANG Li1，3（1. School of Pharmacy， Nanjing University of TCM， Nanjing 210023， China. 2. Jiangsu Rongyu Pharma- ceutical Co.， Ltd.， Jiangsu Huai’an 223001， China； 3. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine， Nanjing 210023， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprints of Ligusticum chuanxiong decoction pieces， and to conduct cluster analysis and PLS-DA analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Waters Symmetry C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.5% acetic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm， and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using ligustilide as control， HPLC chromatograms of 21 batches of samples （S1-S20） were determined. The similarity evaluation was conducted by using Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） to determine common peak. Cluster analysis was conducted by using SPSS 19.0 software and PLS-DA was used to distinguish the samples. RESULTS： There were 25 common peaks in HPLC chromatograms for 21 batches of samples， and 9 common peaks were identified. The similarity of samples was between 0.768-0.989， and the similarity of base and traditional medicinal part samples （S1-S10） were more than 0.970. The 21 batches of samples were clustered into 3 categories， in which S1-S10 were category Ⅰ； S15-S16， S19-S20 were category Ⅱ； other were category Ⅲ. By PLS-DA analysis， 11 classification markers were identified as well as 5 chromatogram peaks were identified， such as ferulic acid， pine cyperyl ferulate， n-butyl phthalide， ligustilide， ligustilide A， which could be used to distinguish base and non-markted samples （S1-S10） from marketed and non-base samples （S11-S21）， which were consistent with the results of cluster analysis. CONCLUSIONS： Established fingerprint， cluster analysis and PLS-DA analysis can provide reference for quality evaluation of L. chuanxiong decoction pieces. 　　KEYWORDS Ligusticum chuanxiong； HPLC； Fingerprint； Cluster analysis； PLS-DA
　　川芎为伞形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎，原名芎[穷] [1]，主产于四川彭州、都江堰、什邡等地[2]。川芎辛温，具有活血行气、祛风止痛的功效[3]。有研究报道，川芎含有苯肽类[4-5]、有机酸类[5-6]、多糖类[5-7]、生物碱类[5-6]等成分，具有抗血小板聚集[2，8]、抗血栓形成[9]、止痛[7]等作用。
　　川芎作为新生化颗粒的重要原料，旨在活血行气、去除体内淤血，其饮片质量的稳定、优质与新生化颗粒的质量息息相关，故有必要对川芎饮片的质量进行全面、综合的评价。2015年版《中国药典》（一部）以水溶性成分阿魏酸的含量作为川芎质量控制的指标[3]。虽然也有学者对川芎中的多种成分同时进行了定量分析[10-11]，但仍无法全面地评价川芎饮片的质量。
　　中药指纹图谱具有整体性、相似性的特点，能突出中药的完整面貌，可依据相似度的特点实现对中药内在化学成分的综合评价和整体质量的全面控制[12]。近年来，已广泛用于药材饮片的质量评价[13-14]。为此，本研究采用高效液相色谱（HPLC）法建立了21批样品的指纹图谱，并采用聚类分析和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）对川芎饮片进行综合评价，同时结合模型变量投影（VIP）参数区分各批样品，以期为其质量控制提供参考。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　2695-2998型HPLC仪，包括四元高压溶剂管理系统、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、真空脱气机、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；MS-105DU型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；D3024型台式高速微量离心机（美国Scilogex公司）；XFB-200型高速中药粉碎机（吉首市中诚制药机械厂）；KH-500DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。
　　1.2 药品与试剂
　　阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110773-201614，纯度：≥99%）；绿原酸对照品（批号：Y24J7K16726，纯度：≥98%）、阿魏酸松柏酯对照品（批号：Z02S8B42740，纯度：≥98%）、洋川芎内酯A对照品（批号：P31AIF42747，纯度：≥98%）均由上海源叶生物科技有限公司提供；洋川芎内酯I对照品（批号：JBZ- 1468，纯度：≥98%）、洋川芎内酯H对照品（批号：JBZ- 1467，纯度：≥98%）、正丁基苯酞对照品（批号：JBZ- 1641，纯度：≥98%）、丁烯基苯酞对照品（批号：JBZ- 0285，纯度：≥98%）、藁本内酯对照品（批号：JBZ-0405，纯度：≥98%）均由南京金益柏生物技术有限公司提供；乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）；冰乙酸（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；无水甲酸（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；水为超纯水。
　　1.3 药材
　　共收集21批样品，经南京中医药大学药学院严辉副教授鉴定为伞形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎。样品来源见表1。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　色谱柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0～25 min，5%A→45%A；25～35 min，45%A→55%A；35～45 min，55%A；45～55 min，55%A→95%A；55～60 min，95%A；60～65 min，95%A→5%A）；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。
　　2.2 溶液的制备
　　2.2.1 混合对照品溶液 精密称取绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、正丁基苯酞、藁本内酯、丁烯基苯酞对照品适量，分别置于10 mL棕色量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，得单一对照品贮备液。取上述各单一对照品贮备液适量，置于同一10 mL棕色量瓶中，加乙腈定容至刻度，制成含绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、正丁基苯酞、藁本内酯、丁烯基苯酞质量浓度分别为48.60、45.60、47.60、36.50、53.30、55.73、202.70、591.20、32.10 μg/mL的混合对照品溶液。
　　2.2.2 供试品溶液 取样品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加5%甲酸甲醇溶液25 mL，称定质量，超声（功率：250 w，频率：40 kHz）处理30 min，放冷，用5%甲酸甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
　　2.3 方法学考察
　　2.3.1 精密度试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S9）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以藁本内酯峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，25个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.7%（n=6），相对峰面积的RSD均小于4.2%（n=6），表明本方法精密度良好。
　　2.3.2 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S9）适量，分别于室温下放置0、4、8、12、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以藁本内酯峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，25个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.1%（n=6），相对峰面积的RSD均小于5.3%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内基本稳定。 　　2.3.3 重复性试验 精密称取样品粉末（编号：S9）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以藁本内酯峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，25个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.1%（n=6），相对峰面积的RSD均小于5.7%（n=6），表明本方法重复性良好。
　　2.4 HPLC指纹图谱的生成与相似度、共有峰相关分析
　　2.4.1 HPLC指纹图谱的生成 取21批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 A版）对各批样品的HPLC指纹图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。
　　2.4.2 相似度分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 A版）对样品进行相似度分析，以传统药用部位18批样品（编号：S1～S10、S14～S21）为对照，进行整体相似度评价。结果显示，21批样品的相似度为0.769～0.989，其中市售、非基地、非传统药用部位样品（编号：S11～S13）相似度为0.848～0.872，表明其与非市售、基地、传统药用部位样品（编号：S1～S10）比较，两者的化学成分存在一定差异。编号为S21批样品相似度仅为0.769，主要为绿原酸、9号峰、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯峰的峰面积差异较大导致。18批样品（编号：S1～S10、S14～S21）中，除S17、S18、S21批样品相似度较低（<0.90）外，其余15批样品相似度均大于0.90，表明部分市售、非基地、传统药用部位样品（编号：S14～S16、S19～S20）与非市售、基地、传统药用部位样品（编号：S1～S10）具有较好的相似性，详见表2。
　　2.4.3 共有峰的指认及相关分析 21批样品共有25个共有峰，通过与混合对照品溶液HPLC图（见图3）对比，指认出5号峰为绿原酸、8号峰为阿魏酸、10号峰为洋川芎内酯I、11号峰为洋川芎內酯H、14号峰为阿魏酸松柏酯、16号峰为洋川芎内酯A、17号峰为正丁基苯酞、21号峰为藁本内酯、22号峰为丁烯基苯酞。由于藁本内酯峰（21号峰）信号强、峰形好，故以其保留时间和峰面积为参照，计算其他峰相对于藁本内酯峰的相对保留时间和相对峰面积，详见表3～表6。
　　2.5 聚类分析
　　以各共有峰的绝对峰面积为指标，采用SPSS 19.0软件，结合平均连接法以欧氏距离为测度进行聚类分析，详见图4。由图4可知，21批样品可聚为3类：S1～S10聚为一类，S15～S16、S19～S20聚为一类，其余聚为一类。S15～S16、S19～S20批样品与10批非市售、基地、传统药用部位样品（编号：S1～S10）距离接近，与相似度评价结果基本一致。
　　2.6 PLS-DA分析
　　对21批样品进行PLS-DA分析，以25个共有峰的峰面积（X）为自变量、样品（Y）为因变量，绘制PLS-DA模型得分图，详见图5。由图5可知，非市售、基地、传统药用部位样品（编号：S1～S10）集中分布在模型得分图的左侧，其余样品（编号：S11～S21）零散分布在右侧；S15～S16、S19～S20聚为一类，与非市售、基地、传统药用部位样品（编号：S1～S10）距离较近，该结果与聚类分析、相似度评价结果基本一致。PLS-DA模型中变量的解释度（R2Y） =0.930，模型的预测度（Q2）=0.869，均接近1，表明所建模型可靠。进一步对模型变量投影（VIP）进行分析，筛选影响样品分类的变量色谱峰，以VIP>1为筛选标准，共得到贡献相对较大的11个变量色谱峰，依次为14号峰（阿魏酸松柏酯，VIP=1.563）、17号峰（正丁基苯酞，VIP=1.533）、21号峰（藁本内酯，VIP=1.516）、16号峰（洋川芎内酯A，VIP=1.468）、18号峰（VIP=1.453）、23号峰（VIP=1.453）、20号峰（VIP=1.316）、3号峰（VIP=1.231）、19号峰（VIP=1.187）、9号峰（VIP=1.055）、8号峰（阿魏酸，VIP=1.032），详见图6。
　　2.7 分类标志物相对峰面积比值分析
　　以变量色谱峰作为分类标志物，得到11个分类标志物，其中14号峰（阿魏酸松柏酯，VIP=1.563）VIP值最大。进一步比较非市售、基地、传统药用部位样品（编号：S1～S10），市售、非基地、非传统药用部位样品（编号：S11～S13），市售、非基地、传统药用部位样品（编号：S14～S21）中16号峰（洋川芎内酯A）与14号峰的相对峰面积比值，分别为0.450±0.018、1.685±0.172、1.625±0.848；17号峰（正丁基苯酞）与14号峰的相对峰面积比值分别为0.019±0.002、0.103±0.005、0.072±0.036；21号峰（藁本内酯）与14号峰相对峰面积比值分别为1.663±0.062、5.195±0.529、6.177±3.544。这提示，分类标志物的相对峰面积比值可进一步明显区分非市售、基地、传统药用部位样品（编号：S1～S10）与市售、非基地、非传统药用部位样品（编号：S11～S13）及市售、非基地、传统药用部位样品（编号：S14～S21）。
　　3 讨论
　　本研究建立的HPLC指纹图谱能较好地反映川芎饮片的整体特征，并指认出9个共有峰，分别为绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、正丁基苯酞、藁本内酯、丁烯基苯酞。
　　笔者在前期试验中，将供试品溶液于全波长（190～400 nm）扫描，发现在254、280 nm波长下色谱图基线较平稳，色谱峰数目相当，但在280 nm波长下参照峰（藁本内酯峰）响应较高，故选择254 nm为检测波长。笔者参考相关文献[15]，发现阿魏酸松柏酯峰在乙腈、5%甲酸甲醇溶液中相对稳定，故以此为提取溶剂进行考察；同时又比较了不同超声时间（30、45、60 min）、不同色谱柱（Waters Symmetry C18、Hanbon Sci & Tech）对色谱行为的影响，结果以Waters Symmetry C18为色谱柱、5%甲酸甲醇溶液为提取溶剂、超声处理30 min时，色谱峰峰形较好、色谱峰数目相对较多。 　　相似度评价、聚类分析、PLS-DA分析结果显示，市售、非基地、传统药用部位样品（编号：S15～S16、S19～S20）的相似度与非市售、基地、传统药用部位样品（编号：S1～S10）较为接近。VIP分析得到11个分类标志物，通过与混合对照品比对，指认了阿魏酸、阿魏酸松柏酯、正丁基苯酞、藁本内酯、洋川芎内酯A等5个色谱峰，这5个色谱峰可有效区分非市售、基地样品与市售、非基地样品；而对于其他未明确的成分，仍有待后续研究进一步探讨。
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　　（收稿日期：2018-10-17 修回日期：2019-02-22）
　　（編辑：陈 宏）
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