地黄SCoT分子标记体系的建立和指纹图谱的构建

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　　摘 要：該研究采用L25（56）正交设计和单因素两种方法，对影响地黄SCoT-PCR反应的5个因素（模板 DNA 浓度，引物浓度，ddH2O和Mix的用量以及退火温度）进行了优化。结果表明：优化后的反应体系总体积为25 μL，含有8 μL ddH2O，1 μL模板DNA（80 ng·μL-1），1 μL引物（8 μmol·L-1）和15 μL Mix，退火温度为45 ℃。运用30份地黄种质材料，对优化的SCoT-PCR正交体系进行多次重复验证，获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱，证明该反应体系稳定可靠。利用该体系对32条SCoT引物进行两次筛选，得到14个扩增产物清晰、重复性好且多态性条带相对较高的引物。利用SCoT4等5条引物构建了上述地黄2个种共30份种质的SCoT指纹图谱。利用这5个SCoT引物指纹图谱可将7个地黄常用栽培品种区分开。这表明SCoT分子标记体系适用于地黄主要品种亲缘关系及遗传多样性的研究，所构建的指纹图谱也为地黄常见的7个栽培品种的区分提供参考依据。
　　关键词： 目标起始密码子多态性（SCoT）， 单因素试验， 正交设计， 引物筛选， 品种鉴定
　　中图分类号：Q949.9， O413
　　文献标识码：A
　　文章编号：1000-3142（2019）05-0608-07
　　SCoT molecular marker system and fingerprintin Rehmannia glutinosa
　　YANG Ke1， ZHOU Yanqing1，2，3*， DUAN Hongying1， GUO Mengmeng1
　　（ 1. College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China; 2. Key Laboratory for Microorganisms and FunctionalMolecules， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China; 3. Engineering Technology Research Center of Nursing andUtilization of Genuine Chinese Crude Drugs， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China ）
　　Abstract：We used L25（56） orthogonal design and single factor method to optimize the five factors （template DNA concentration， primer concentration， ddH2O， Mix amount and annealing temperature） that affect the SCoT-PCR reaction ofRehmannia glutinosa. The results were as follows： The reaction system was a total volume of 25 μL containing 8 μL of ddH2O， 1 μL of template DNA （80 ng·μL-1）， 1 μL of primer （8 μmol·L-1） and 15 μL of Mix， and an annealing temperature of 45℃. The optimized SCoT-PCR orthogonal system was repeatedly verified by using 30 parts of Rehmanniagermplasm materials， and the amplified spectrum with rich polymorphism and clear bands was obtained， which proves that the reaction system is stable and reliable. Using this system， 32 SCoT primers were screened twice， and 14 primers with clear， reproducible and relatively high polymorphic bands were obtained. Finally， SCoT fingerprints of 30 species of the above two species of Rehmannia were constructed by using five primers such as SCoT4. Using these five SCoT primer fingerprints， seven common cultivars of Rehmannia glutinosacan be distinguished. The study indicates that the SCoT molecular marker system is suitable for the study of genetic relationship and genetic diversity of the main varieties of Rehmannia glutinosa. The fingerprints constructed also provide reference for the differentiation of seven cultivars commonly found in Rehmannia glutinosa. 　　Key words： target initiation codon polymorphism （SCoT）， single factor test， orthogonal design， primer screening， variety identification
　　地黄（Rehmannia glutinosa）是玄参科地黄属多年生草本植物，包括天目地黄、裂叶地黄、高地黄、湖北地黄、茄叶地黄与地黄6个种，分布于中国、日本和韩国等国家。在我国，地黄主要分布于河南、山西、辽宁、山东、陕西和安徽等地。地黄根作为药材和食材，具有重要的经济价值。因此，地黄备受人们青睐，广为研究。
　　就地黄DNA分子标记研究而言，迄今已有RAPD、ISSR、SRAP、SCAR、ITS、AFLP、叶绿体DNA非编码区片段和EST-SSR分子标记应用于地黄遗传多样性评价、分类、鉴定、指纹图谱、居群遗传关系、结构及诊断茎尖快速繁殖地黄品种和F1代杂种（周延清等，2015;王婉珅，2016;夏至等，2016）、种的鉴定等方面（冯法节等， 2015;Liu et al.， 2015）。但是，这些标记各有缺点。譬如，RAPD标记、AFLP标记和SSR标记依次具有不稳定性、费时与昂贵和难以开发等缺点，所以，需要开发新地黄分子标记。目标起始密码子多态性分子标记（start codon targeted polymorphism，SCoT）标记是一种基于单引物扩增反应的新型目的基因分子标记，是根据植物基因ATG起始密码子侧翼保守区域设计单引物，对基因组中ATG两侧的区域进行扩增，产生偏向候选功能基因区显性多态性标记，具有能获得与性状联系紧密的目的基因、能对性状进行跟踪、操作简单、重复性好﹑多态性丰富与引物通用性好等优点，已被广泛应用于硬粒小麦遗传多样性分析（Guo et al.，2016）、间接器官发生途径再生火索麻植株的遗传纯合率（Mariappan et al.，2016）、基因差异表达和分子遗传连锁图谱构建等方面（龙治坚等，2015）。
　　迄今，SCoT标记技术尚未见地黄应用方面的报道，从分子角度探讨地黄遗传多样性和亲缘关系的研究也相对较少（陈大霞等，2012）。因此，本研究以开发地黄新分子标记为目的，以地黄为材料，构建与优化地黄SCoT-PCR体系，并筛选合适引物，对30份种质进行了SCoT指纹图谱的构建，为地黄遗传多样性分析和品种鉴定等研究奠定基础，也为地黄常见的7个栽培品种红薯王、抗育831、北京3号、北京2号、金状元、金九和温85-5的区分提供参考依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　所用地黄种质收集于河南4个市县、山东2个区县和上海华东师范大学，包括裂叶地黄（Rehmannia piasezkii）和地黃（Rehmannia glutinosa）这2个种，共30份种质。具体如下：1.灵宝野生;2.上作1;3.山西北相;4.金线吊鱼;5.密县野生;6.郭里毛;7.红薯王;8.组培9302;9.抗育831;10.古贤地黄;11.皇后杂;12.北京3号;13.灵宝野生;14.三块;15.方庄地黄;16.温怀地黄;17.北京2号;18.金状元;19.范山地黄;20.狮子头;21.上作2;22.张寺961;23.金九;24.文昌地黄;25.泰山地黄;26.舞阳地黄;27.野生地黄;28.裂叶地黄;29.温85-5;30.卫辉地黄。其中，1-23号取自温县农科所，24号取自济南文昌山，25号取自济南泰安泰山，26号取自漯河舞阳县，27号取自灵宝县胡家原村，28号取自华东师范大学，29号取自河南师范大学，30号取自卫辉市比干庙。2016年5月由研究生王婉珅采集的新鲜幼嫩叶子， 每个产地共采集三株作为重复，经硅胶快速干燥后保存于-70 ℃冰箱备用。均经过河南师范大学段红英教授鉴定和王婉珅研究生ITS测序与NCBI比对，确定为裂叶地黄或地黄种质（王婉珅，2016）。试验用的Taq MasterMix由北京康为世纪生物科技有限公司合成。从文献（陈大霞等，2012;李丕睿等， 2013;蒋雅琴等， 2014）查选的32个单引物序列，由北京三博远志生物公司合成，命名为SCoT1-SCoT32。
　　1.2 DNA的提取与检测
　　取新鲜地黄叶片，根据改良的CTBA提取叶片DNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，将样品按所需浓度稀释，置于-20 ℃ 条件下保存备用。
　　1.3 基础SCoT-PCR体系的建立与目标引物的筛选
　　根据文献（徐林涛， 2015; Guo et al.， 2016; Mahjbi et al.， 2015）初步建立基础的地黄SCoT-PCR反应体系，对32条引物进行初次的筛选。SCoT-PCR反应体系为20 μL，包含8 μL ddH2O、1 μL模板DNA（80 ng·μL-1）、1 μL引物（8 μmol·L-1）、10 μL Mix。扩增程序：94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，36个循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，拍照分析。
　　1.4 SCoT-PCR的正交试验设计
　　温85-5为地黄最常见的栽培品种。选取温85-5品种DNA为模板，以1.3中筛选的SCoT15为引物，针对模板DNA浓度、引物浓度、ddH2O体积、PCR反应体系中 Mix的用量和退火温度5种因素设置5个不同水平（表1）。采用 L25（56）正交试验设计对基础SCoT-PCR 进行体系优化，2次重复。PCR 扩增反应在梯度PCR 仪Tgradient上进行，扩增程序：94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性1min，退火温度的设定依据正交表1 min，72 ℃延伸2 min， 36个循环;4 ℃保存。扩增结束后，吸取扩增产物 8～10 μL进行 1%琼脂糖凝胶电泳，电极缓冲液为 1×TAE，在Gel DoctmEZ凝胶成像仪拍照。 　　1.5 退火温度优化
　　退火温度是影响 PCR 特异性的重要因素。根据正交试验筛选出的最有体系设计单因素试验，对退火温度再次进行梯度优化。试验设置了 5个温度梯度： 45.0、47.0、51.3、53.3、55.0 ℃。 除退火温度不同外，反应程序与筛选出的正交试验体系相同。
　　1.6 正交试验最优体系的验证
　　用1.3中筛选的14条引物和1.5中优化后的正交体系，对30份地黄种质DNA模板进行扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，验证该体系的稳定性、通用性和重复性，同时对14条引物进行第二次筛选。对所得的SCoT谱带保存并进行数据分析。
　　1.7 数据处理
　　数据用人工读带的方法，根据SCoT-PCR扩增产物在凝胶电泳上的相对位置，依据分子量从大到小的顺序读带，对电泳图谱上清晰且可辨认的条带记为 1，无条带记为 0，缺失记为 9，模糊不清的不予记录，建立30份地黄种质的SCoT指纹图谱。
　　2 结果与分析
　　2.1 地黄DNA质量和浓度的检测
　　用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，检测结果显示所得的 DNA条带清晰完整，无拖尾和蛋白质污染。取1 μL提取的DNA，以ddH2O作为基准，用微量分光光度计测定其浓度和纯度，OD260/OD280均在1.8～2.0之间，说明所提取的地黄DNA较纯净，无杂质污染，可进行PCR扩增试验。
　　2.2 基础SCoT-PCR体系建立和筛选引物
　　利用基础体系与扩增程序，以温85-5、金九、金状元、红薯王等地黄常见栽培种质的DNA模板，对32条 SCoT 引物进行SCoT-PCR筛选（图1）。初次获得扩增产物清晰、重复性好且多态性条带相对较高的14条引物SCoT4：ACCATGGCTACCACCGCG;SCoT5：ACGACATGGCGACCGCGA;SCoT11：CAACAATGGCTACCACGT;SCoT14：AAGCAATGGCTACCACCA;SCoT15：ACGACATGGCGACCATCG;SCoT16：ACGACATGGCGACCACGC;SCoT19：ACCATGGCTACCACCGGC;SCoT21：GCAACAATGGCTACCACC;SCoT23：ACCATGGCTACCACCGCA;SCoT25：CCATGGCTACCACCGGCC;SCoT26：CCATGGCTACCACCGGCG;SCoT27：CCATGGCTACCACCGCCT;SCoT28：CCATGGCTACCACCGCAG;SCoT29：ACGACATGGCGACCAACG，并正式用于PCR 扩增。
　　2.3 正交试验的验证
　　从正交试验扩增结果可以看出，25个处理组合中有18个产生谱带，其中10号、14号、16号、18号、20号、22号和23号处理组合没有扩增出产物，5号、6号、7号和19号扩增产物极少，8号和9号处理组合扩增谱带清晰，易于辨认，呈现多态性（图2）。综合各个条带的直观分析，最终确定地黄SCoT-PCR 的最佳反应体系为ddH2O 8 μL，模板DNA用量80 ng·μL-1，引物8 μmol·L-1 ，Mix15 μL，退火温度45 ℃，总体积25 μL。
　　2.4 退火温度优化
　　在研究的 5个退火温度（图3）中，45.0 ℃扩增的条带背景较强，条带易于辨认且特异性强;47.0 ℃和55.0 ℃扩增的条带少且背景较弱;51.3 ℃和53.3 ℃随着退火温度的升高，扩增条带数目增加，背景增强，但当退温度上升到55.0 ℃时，背景又变弱。因此，以条带扩增清晰、呈现多态性为依据，确定本试验的最佳退火温度为45.0 ℃。
　　2.5 地黄最适反应体系的验证
　　用初次筛选的14条引物，对30份地黃种质DNA模板进行SCoT-PCR分析，将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。除SCoT21和SCoT25外，所用引物均能在供试材料中扩增出条带清晰、亮度适中、多态性高的条带。如SCoT15在30份地黄材料中的扩增谱带清晰、易于辨认、呈现多态性（图4）。这说明建立和优化的SCoT分子标记反应体系适用于地黄基因组DNA的遗传多样性等后续研究。
　　2.6 SCoT引物扩增分析
　　通过对32条SCoT引物的两次筛选，得到14个扩增产物清晰、重复性好且多态性条带相对较高的引物。利用筛选的14条SCoT引物对30份地黄种质资源进行扩增分析，研究结果表明：（1） 14条SCoT引物对30份地黄材料共扩增出103个位点，其中多态性位点有96个，多态率达94.2%;（2） 30份材料的遗传相似系数在0.471 9～0.922 3之间，平均遗传相似系数为0.70，说明 SCoT 标记能够显示品种间较高的遗传多样性。在最终选择5条引物用于构建30份地黄种质的指纹图谱，利用这5条SCoT多态性引物指纹图谱可将7个地黄常用栽培品种区分开。
　　2.7 指纹图谱构建
　　根据5条引物SCoT4、SCoT5、SCoT11、SCoT15和SCoT 27的扩增结果，对电泳图谱上清晰且可辨认的条带记为1，无条带记为0，缺失记为9，模糊不清的不予记录，建立30份地黄种质的SCoT指纹图谱数字化表格（表2），利用此5条SCoT多态性引物可有效区分地黄7个常用栽培品种。利用引物SCoT4产生的特异性条带可以将北京2号、金状元和金九区分开，引物SCoT27可将红薯王和抗育831区别开，利用引物SCoT5可扩增出北京3号的特异性条带，引物SCoT11可产生温85-5的特异性条带，引物SCoT27能扩增出金九的特异性条带。
　　3 讨论
　　本研究筛选的14条 SCoT引物在30份地黄资源中具有很高的多态性，平均多态率达到94.2%，其引物多态性效果比一些报道的结果好。如李丕睿等（2013）对18份菊花材料进行多样性研究发现，12 条 SCoT引物的平均多态率为90.4%;在蒋雅琴等（2014）对81份丝瓜品种的研究中，10条引物的多态率为87.57%。利用这些引物能在部分栽培品种中扩增出特异性条带，这些特异性条带是否与特定性状有关，还需要进一步研究证明。 　　本研究以开发地黄新分子标记为目的，克服上述SCoT-PCR技术的不足，建立并优化出适宜的地黄SCoT-PCR反应体系，即总体积25 μL，包含ddH2O 8μL，模板DNA用量80 ng·μL-1，引物8 μmol·L-1，Mix 15 μL，退火温度45 ℃。该SCoT-PCR 体系已在地黄栽培种、地黄属的2个不同种之间、农家种与野生种上进行了通用性和稳定性验证，都得到了特异性丰富的谱带，表明其适于地黄属种质的指纹图谱构建和鉴定及遗传多样性分析等，也为其SCAR标记开发等后续研究奠定了基础。
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