p16与ER在乳腺癌中表达的相关性
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摘要：目的 探讨p16基因表达与雌激素受体（ER）的相关性，分析其在ER阴性乳腺癌中的可能应用。方法 选取常州市第一人民医院2016年5月～2018年6月手术治疗的乳腺癌石蜡标本181例为研究对象，使用免疫组织化学（SP法）分别检测乳腺癌组织中ER和p16蛋白表达，分析乳腺癌组织中p16蛋白表达与ER的关系及其与不同亚型乳腺癌临床病理参数的关系。结果p16蛋白在ER阳性和ER阴性乳腺癌组织中阳性率分别为56.19%（59/105）、35.53%（27/76），差异有统计学意义（P<0.05）;ER阴性乳腺癌中，p16蛋白表达与患者的淋巴结转移数、临床分期均相关（P<0.05），与年龄、肿块大小及组织学分级无关（P>0.05）。结论 p16蛋白表达的缺失可能主要出现在ER阴性乳腺癌中，上调抑癌基因p16的表达有可能作为ER阴性乳腺癌一个潜在的治疗靶点，p16蛋白表达的检测也有可能成为ER阴性乳腺癌患者预后评估的一个参考指标。
关键词：p16;ER阳性;ER阳性;乳腺癌
中图分类号：R365 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.10.025
文章编号：1006-1959（2019）10-0075-03
Abstract：Objective To investigate the relationship between p16 gene expression and estrogen receptor （ER） and analyze its possible application in ER-negative breast cancer.Methods A total of 181 paraffin-embedded specimens of breast cancer from the First People's Hospital of Changzhou from May 2016 to June 2018 were selected. Immunohistochemistry （SP method） was used to detect ER and p16 proteins in 181 breast cancer tissues. Expression and analysis of the relationship between p16 protein expression and ER in breast cancer tissues and its relationship with clinical pathological parameters of different subtypes of breast cancer.Results The positive rates of p16 protein in ER-positive and ER-negative breast cancer tissues were 56.19% （59/105） and 35.53% （27/76）， respectively，the difference was statistically significant （P<0.05）.②In ER-negative breast cancer， p16 protein expression was correlated with lymph node metastasis and clinical stage （P<0.05）， and was not associated with age， mass size and histological grade （P>0.05）.Conclusion The deletion of p16 protein may be mainly found in ER-negative breast cancer. The up-regulation of p16 expression may be a potential therapeutic target for ER-negative breast cancer. The detection of p16 protein expression may also be a patient with ER-negative breast cancer. A reference indicator for prognostic assessment.
Key words：p16;ER positive;ER positive;Breast cancer
根據雌激素受体（estrogen receptor，ER）表达状态可将乳腺癌分为ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌[1]。因乳腺癌具有高度异质性，ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌在发病机制、临床病理特征、治疗反应和预后等方面均有很大差异。因此，在越来越追求个体化治疗的今天，进一步研究ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌的分子生物学特征显得十分必要。抑癌基因p16位于人染色体9p21，属于周期依赖性激酶抑制因子CDK1家族，其蛋白产物可调节细胞的增值与凋亡和阻止因DNA损伤引起的细胞增值[2]。目前已经证实p16蛋白在乳腺癌中呈低表达状态[3]，但其在ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌中表达是否一致尚不清楚。本实验分别检测181例乳腺癌组织中p16和ER表达情况，并结合临床病理资料进一步分析p16在乳腺癌中的表达与ER的相关性。 1材料与方法
1.1一般资料 收集常州市第一人民医院2016年5月～2018年6月手术治疗的乳腺癌石蜡标本181例，经病理检测证实全部为浸润性导管癌。患者全部为女性，年龄24～88岁，中位年龄52岁;组织学分级（WHO分标准）级：Ⅰ级30例、Ⅱ级87例、Ⅲ级64例;淋巴结转移：62例淋巴结（腋窝）转移数>3，119例为0～3;临床分期（TNM）：Ⅰ、Ⅱ合并为112例，Ⅲ为69例。所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。p16抗体（BS1265，Bioworld公司）;ER单克隆抗体、SP试剂盒（ZA-0102、SP9000，北京中衫金桥公司）。
1.2方法
1.2.1 ER和p16的检测 使用免疫组织化学染色（SP法），具体步骤为：将5 μm石蜡切片置于65℃烤箱中，过夜孵育;二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，去离子水冲洗5 min，蒸馏水冲洗2遍;采用pH 6.0的柠檬酸溶液进行抗原修复;加入100 μl稀释好的一抗（1∶200稀释），室温下孵育1 h，PBS缓冲液冲洗3次;去掉PBS液后，每张切片再加入100 μl稀释好的二抗（1∶300稀释），在室温下孵育15 min，PBS缓冲液冲洗3次;二氨基联苯胺显色，在显微镜下检验染色质量，最后用中性树胶封片。阴性对照采用PBS缓冲液代替一抗。阳性标准：p16以细胞核和（或）胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数≥10%计为阳性[5]，组织内淋巴细胞或正常的乳腺导管上皮为阳性内对照;ER以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数≥1%计为阳性[6]。
1.2.2 p16蛋白表达与临床病理参数的关系分析 依据乳腺癌组织中ER表达情况将181例样本分为ER阳性组和ER阴性组;分别统计两组患者中p16表达情况、年龄、肿块大小、淋巴结转移情况、组织学分级和临床分期等临床资料。
1.3统计学分析 采用SPSS 16.0软件包进行数据处理，计量资料以（x±s）表示，计数资料采用（%）表示，采用？字2检验。乳腺癌组织p16与ER的表达相关性使用四格表？字2检验，ER阳性组和ER阴性组中p16表达与年龄、淋巴结转移数目、组织学分级和临床分期的相关性使用四格表？字2检验，ER阳性组和ER阴性组中p16表达与肿块大小的相关性使用列联表（R×C）？字2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1乳腺癌组织ER和p16蛋白表达检测 乳腺癌组织细胞中ER表达定位于胞核，癌旁组织p16蛋白表达定位于胞核，乳腺癌组织中p16蛋白阳性表达定位于胞浆或胞核。181例乳腺癌标本中，105例为ER表达阳性，76例为ER表达阴性;ER阳性标本中p16蛋白表达率为56.19%（59/105），ER阴性标本p16蛋白表达率为35.53%（27/76），ER阴性组p16蛋白表达率低于ER阳性组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2乳腺癌组织p16蛋白表达与临床病理参数的关系 105例ER阳性乳腺癌中：p16蛋白表达与患者的年龄、肿块大小、组织学分级、淋巴结（腋窝）转移数及临床分期无关，差异无统计学意义（P均>0.05）;在ER阴性乳腺癌中：淋巴结（腋窝）转移数>3组织中p16蛋白表达率为17.24%（5/29），淋巴结（腋窝）转移数为0～3组织中为46.81%（22/47），差异有统计学意义（P<0.05）;临床Ⅰ+Ⅱ期组织中p16蛋白表达率为44.00%（22/50），Ⅲ期为19.23%（5/26），差异有统计学意义（P<0.05）;p16蛋白表达与患者的年龄、肿块大小、淋巴结转移数及组织学分级无关，差异无统计学意义（均P>0.05），见表2。
3讨论
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有57万例乳腺癌患者发生肿瘤细胞的远处转移[7]，部分早期乳腺癌患者，也会发生隐匿性转移[8]。研究根据乳腺癌标志物ER将乳腺癌分为ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌。有研究表明，乳腺癌不同的肿瘤标志物可反映其不同的生物学行为[9]，而且乳腺癌有高度异质性，由于乳腺癌ER表达状态的不同，ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌在发病机制、临床病理特征、治疗反应和预后等方面均有很大差异。
乳腺癌的发生是一个多因素、多步骤的病理过程，主要涉及癌基因的激活与抑癌基因的失活。抑癌基因p16是细胞周期依赖激酶家族抑制蛋白（CKIs）成员之一，可编码一个由148个氨基酸组成的蛋白质，在限制点（R点）与D型细胞周期蛋白（cyclinD1）竞争性结合CDK4/CDK6，抑制CDK4/CDK6的作用，降低Rb蛋白磷酸化水平，从而阻止细胞通过限制点R点由G1期进入S期。因此，当p16蛋白不能正常表达时，会导致细胞无限增殖，进一步引起肿瘤的发生[10，11]。目前已经证实p16蛋白在乳腺癌中呈低表达状态[3]，但其在ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌中表达是否一致尚不清楚。本实验分别检测181例乳腺癌组织中p16和ER表达情况，并结合临床病理资料进一步分析p16在乳腺癌中的表达与ER的相关性。
国外学者對乳腺癌中12种生长抑制基因的甲基化状态和ER及孕激素受体的关系进行了分析，结果发现p16蛋白表达和ER表达无相关性[12]。Kozomara Z等[13]研究表明，p16蛋白表达和ER表达呈正相关。为了进一步探索p16 蛋白表达与ER的关系，本研究用SP法分别检测了181例乳腺癌组织中ER和p16 蛋白表达情况。结果显示，ER阳性标本中p16蛋白表达率为56.19%（59/105），ER阴性标本p16蛋白表达率为35.53%（27/76），ER阴性组p16蛋白表达率低于ER阳性组，差异有统计学意义（P<0.05）。根据以上实验结果可以推测，抑癌基因p16 的表达可能和ER有关，p16蛋白表达的缺失可能主要出现在ER阴性乳腺癌中。 由于乳腺癌的异质性以及ER阳性和ER阴性乳腺癌患者在临床病理、治疗方法及预后的不同，我们又分别分析了p16蛋白表达与ER阳性和ER阴性乳腺癌临床病理参数的关系，结果显示ER阳性乳腺癌中：p16蛋白表达与患者的年龄、肿块大小、组织学分级、淋巴结（腋窝）转移数及临床分期无关（P>0.05）。但在ER阴性乳腺癌中：淋巴结（腋窝）转移数>3组织中p16蛋白表達率为17.24%（5/29），淋巴结（腋窝）转移数为0～3组织中为46.81%（22/47），差异有统计学意义（P<0.05），临床Ⅰ+Ⅱ期组织中p16蛋白表达率为44.00%（22/50），Ⅲ期为19.23%（5/26），差异有统计学意义（P<0.05），p16蛋白表达与患者的年龄、肿块大小、淋巴结转移数及组织学分级无关（P>0.05）。可见，p16蛋白表达可能只与ER阴性乳腺癌临床病理参数有关。淋巴结转移和临床分期是乳腺癌治疗和预后评估的重要参考，本实验结果显示，ER阴性组中p16蛋白表达率在淋巴结（腋窝）转移数>3和临床Ⅲ期中，分别明显低于淋巴结（腋窝）转移数为0～3和临床Ⅰ+Ⅱ期，差异有统计学意义（均P<0.05），因此抑癌基因p16有可能作为ER阴性乳腺癌一个潜在的治疗靶点，p16蛋白表达的检测也有可能成为ER阴性乳腺癌患者预后评估的一个参考指标。
综上所述，p16蛋白表达的缺失可能主要出现在ER阴性乳腺癌中，上调抑癌基因p16的表达有可能作为ER阴性乳腺癌一个潜在的治疗靶点，p16蛋白表达的检测也有可能成为ER阴性乳腺癌患者预后评估的一个参考指标，但尚需在更多样本上的进一步验证。
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收稿日期：2019-2-20;修回日期：2019-3-7
编辑/成森
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