翅形态特征在重阳木斑蛾成虫性别鉴定中的应用

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　　摘要 為了明确重阳木斑蛾的翅形态特征在其性别鉴定中的作用，探索雌雄难于区分的成虫的数值鉴定方法。采用图像处理与分析技术，通过爱普生扫描仪获取重阳木斑蛾前翅图，利用BugShape v1.0软件提取雌雄成虫翅的轮廓特征，利用tpsDig2软件获取翅脉交叉点位置特征，并利用独立样本t检验和标志点空间普氏叠加和扭曲分析，以明确此类特征在该成虫雌雄鉴定中的作用。结果表明，重阳木斑蛾成虫左右前翅轮廓特征在同一性别中差异不显著。仅利用左前翅数据进行分析时，翅面积、短轴长度、等效圆半径、偏心率、球状性和圆形度在两个性别中存在极显著差异，周长和长轴长度的差异达到显著水平，而紧凑度和叶状性差异不显著。使用左右前翅作为数据集进行分析时，除紧凑度和叶状性差异仍不显著外，其余参数均达到极显著水平。雌雄前翅轮廓特征作为指标来判别性别时正确率为100%，但存在左右翅相互错判现象。翅膀内部翅脉交叉点的空间位置在个体间存在较大差异，主要表现在相对于翅的横向方向变异大。雌雄间的差异主要存在于外缘附近的翅脉交叉点。结论：通过前翅的轮廓特征可以区分重阳木斑蛾雌雄成虫的差异。翅脉交叉点空间位置在雌雄间和个体间存在一定的变异。
　　关键词 重阳木斑蛾; 数值分类; 特征提取; 翅脉交点; 雌雄判别
　　中图分类号： S 431.9
　　文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018310
　　Abstract Picture processing and analysis technology was employed to clarify the effects of wing morphological characteristics of Histia rhodope adults on sex recognition and explore the numerical identification method for these adults whose sex is hard to recognize. Forewing images of H.rhodope were captured by flatplate scanner （Epson Perfection V370 Photo） with transparent adapter. The contour feature of wings from female and male adults was extracted by the software BugShape v1.0， and the landmarks of veinjunctions were acquired using tpsDig2. Independentsample t test， Procrustes superimposition of the landmarks and relative warps were computed to verify the effects of the parameters on sex identification. The results showed that there was no significant difference in contour features between two side wings from the same sexual cases. Data analysis based on the left wings showed that the most parameters， such as area， short axis length， equalradius， eccentricity， sphericity and circularity， exhibited highly significant differences （α=0.01）， or significant difference （α=0.05） in terms of perimeter and long axis length， but no significant difference existed in compactness and lobation between male and female samples. However， except for the two parameters compactness and lobation， the difference was highly significant （α=0.01） in the other parameters between male and female adults. Although some samples were not assigned to right groups between left and right wings， the accuracy distinguishing males and females was up to 100% by using forewing outline features as indicators. The spatial positions of vein landmarks showed remarkable variation， especially in transverse direction of wings， between male or female samples. There was wide variation between female and male adults in the vein landmark positions nearby the outer margin of wings. It is concluded that the difference between male and female H.rhodope adults can be distinguished by using the contour feature of fore wings. Some variation exists among the sexes and samples in the spatial position of the vein landmarks. 　　Key words Histia rhodope; numerical taxonomy; feature extraction; veinjunction; sex identification
　　重阳木斑蛾Histia rhodope Cramer，又名重阳木帆锦斑蛾[1]、重阳木锦斑蛾[2]，属于鳞翅目Lepidoptera斑蛾科Zygaenidae昆虫，其寄主植物除重阳木Bischofia trifoliata Hook外，还包括板栗Castanea mollissima Blume[3]。据《中国农业昆虫》和《中国蛾类图鉴（Ⅰ）》描述，该害虫雄蛾翅展47～54 mm，雌蛾61～64 mm[45]。1983年戴凤凤报道江西德兴县大茅山地区重阳木斑蛾雌雄成虫翅展分别为50～60 mm和44～50 mm[6]。另据报道，在福州该虫的体长、翅展和翅长在雌雄间无明显差异[7]。通过文献比较，我们发现不同地区或不同年份关于重阳木斑蛾雌雄成虫翅展或翅长的描述不尽相同，雌雄个体间在翅形和翅长等方面有无差异存在一定争议。
　　图像处理与分析技术的发展为此类问题的解决提供了强有力的工具。利用相关技术，国内外有许多关于不同种类昆虫翅形结构差异等方面的报道。比如，在膜翅目Hymenoptera昆虫中，Weeks等在20世纪末报道了5种姬蜂科Ichneumonidae昆虫的翅形态差异，并实现了此类昆虫的种类鉴定[89]，出现了用于此类昆虫形态特征提取与鉴定的软件ABIS[10]和DrawWing[11]。在鳞翅目Lepidoptera昆虫鉴定中，Watson等利用DAISY（digital automated identification system）系统对237种（每种20个进行训练）活体标本图像进行了分析，平均正确率83%，而无法对鳞片缺失或光照不均匀图片进行正确的归类[12]，后续通过对35种鳞翅目昆虫774个活体标本的处理，并通过数据挖掘分析，成功率略有上升，达到85%[13]。而Zhu 等使用翅图的颜色特征，如颜色直方图和灰度共生矩阵等特征，对100种鳞翅目昆虫的正确识别率为71.1%[14]。除了利用与上述颜色或光照影响相关的特征外，利用翅轮廓特征对昆虫进行分类鉴定效果要好一些，如Yang等利用翅轮廓特征对120张7种蝶角蛉Ascalaphidae图片进行分析，准确率为90%～98%，而再添加复眼特征后，准确率会上升到99%[15]。这说明，依托昆虫数字化技术的数值分类效果与特征选择有很大关系，同时也与昆虫种类有密切关系。根据上述研究结果，可以初步认为翅形等特征是昆虫数值分类鉴定中的重要参数来源。
　　为了明确重阳木斑蛾成虫不同性别之间在翅形态结构上的差异，本研究拟利用图像处理与分析技术，对信阳地区发生的重阳木斑蛾进行形态测量学研究。研究结果不但可以为鳞翅目昆虫数值分类提供理论依据，为此类昆虫种類的远程鉴定筛选有效的参数，也为此类昆虫成虫的雌雄鉴定提供技术保障，为解决蝶类等雌雄难辨昆虫的性别鉴定提供一种方法。
　　1 材料与方法
　　1.1 标本处理
　　本试验中的重阳木斑蛾成虫（图1）采集时间为2017年8月20日，采集地点为河南省信阳市信阳农林学院校内，采集之前未使用化学农药进行防治，可以排除使用杀虫剂对成虫翅形态特征的影响。从整理后的标本可以看出雌雄间除个体大小有差异外，腹部黑斑的大小以及黑斑间距在雌雄个体间有明显不同，但从生态照片上很难进行区分（图1）。
　　雌雄成虫各50头进行乙酸乙酯熏蒸处理，剪取前后翅并使用化学去鳞方法[16]，去除翅表鳞片，制作成翅脉标本。最终选择翅面无折叠、无破损的完整翅脉标本雌雄各19头进行图像获取和特征提取，共得到雌雄左前翅图片各19张，雌虫右前翅图片16张，雄虫右前翅图片13张。而由于后翅柔软、易破损，只得到雌虫左后翅图1张、右后翅图6张，雄虫右后翅图3张，这部分数据过少，未做分析。
　　1.2 图像获取
　　本研究使用爱普生平板式扫描仪（Epson Perfection V370 Photo）作为翅图像获取的主要工具。通过比较几种扫描模式（胶片、反射稿、反射稿+平面光源）的图像效果，最终选择使用胶片模式进行扫描，分辨率设定为2 400 dpi。每个翅作为独立文件保存为.bmp格式，以便后期各软件的特征提取。
　　1.3 特征提取
　　本研究首先使用了由中国农业大学IPMist实验室开发的BugShape v1.0软件[17]，对翅的外部形态特征进行了自动获取，为保证提取的参数能准确代表翅的轮廓特征，每张翅图提取两次，一次为所有参数由软件自动调节，另一次为手动调节，最终得到翅的面积、周长、长轴长度、短轴长度、等效圆半径、偏心率、紧凑度、叶状性和圆形度10个参数[18]。此外，利用美国F. James Rohlf开发的一系列tps软件（http：∥129.49.19.42/ee/rohlf/software.html）进行了翅脉交叉点数据提取与分析，如利用tpsDig2[19]获取重阳木斑蛾前翅内部13个翅脉交叉点数据等。
　　1.4 分析方法
　　同一性别重阳木斑蛾左右前翅看作两个处理，不同性别前翅作为两个处理，利用独立样本t检验检测由BugShape v1.0软件得到的10个参数在不同处理中的差异性。在进行典型判别分析（canonical discriminat analysis）时，把两个性别和左右两侧的翅分别看作不同的处理，即4个处理（雌性左翅、雌性右翅、雄性左翅和雄性右翅），通过获得的参数建立Fisher判别函数，并对各样本进行分组判别，上述分析在SPSS 22.0中进行。而利用tpsDig2获取的翅脉交点坐标，使用其专用的软件tpsSuper进行普氏叠加分析，叠加分析后再利用tpsRelw进行相对扭曲分析[19]，以分析重阳木斑蛾翅内部翅脉交叉点在空间分布上的变化。 　　2 结果与分析
　　2.1 成虫左右前翅形态学参数在同一性别中的差异
　　雌虫数据通过Levene变异数相等测试，各参数的显著性P值在0.123～0.945之间，说明雌虫左前翅和右前翅数据集整齐度好。独立样本t检验（n=19，16）结果表明，各参数的显著性P值范围为0.289～0.878，差异均不显著。同样，在雄虫左右前翅相关参数的检验中，Levence变异数检测中各参数的显著性P值范围为0.339～0.968。独立样本t检验显著性P值范围为0.268～0.991，各参数间差异也不显著（图2）。
　　2.2 雌雄成虫左前翅在形态学参数上的差异
　　大多数情况下，进行鳞翅目昆虫种类的鉴定，利用翅面特征只使用一侧的翅表斑纹等。本文首先分析了雌雄成虫左前翅形态结构特征，结果表明，Levene变异数相等测试表明各参数显著性P值范围为0.228～0.927，处理内各样本间差异很小。独立样本t检验结果表明，左前翅面积（t=5.787，df=36，P<0.001）、短轴长度（t=8.977，df=36，P<0.001）、等效圆半径（t=5.733，df=36，P<0.001）、偏心率（t=-7.966，df=36，P<0.001）、球状性（t=5.420，df=36，P<0.001）和圆形度（t=6.843，df=36，P<0.001）在不同性别间差异达到极显著水平，周长（t=2.641，df=36，P=0.012）和长轴长度（t=2.357，df=36，P<0.024）差异达到显著水平，而紧凑度（t=1.335，df=36，P=0.190）和叶状性（t=-0.664，df=36，P=0.511）在两个性别间差异不显著（图3）。
　　2.3 雌雄成虫双侧前翅形态学参数的差异
　　虽然同一性别成虫左右前翅的形态特征在统计学上差异不显著，可以简单地推断出左右翅基本对称，但可以看出左右翅并不是完全对称的，当左右翅混合使用时，这种微小差异是否会影响性别的最终判定需要做进一步的证明。因此，本文把每一性别左右翅数据重新组合成一个新的数据集，并进行了统计分析。结果表明，Levene变异数据相等测试显著性P值范围为0.076～0.788。独立样本t检验结果表明，雌雄两性间翅面积（t=8.437，df=65，P<0.001）、周长（t=4.478，df=65，P<0.001）、长轴长度（t=4.385，df=65，P<0.001）、短轴长度（t=11.642，df=65，P<0.001）、等效圆半径（t=8.513，df=65，P<0.001）、偏心率（t=-10.090，df=65，P<0.001）、球状性（t=7.907，df=65，P<0.001）和圆形度（t=8.194，df=65，P<0.001）之间的差异均达到极显著水平，而紧凑度（t=1.938，df=65，P=0.057）和葉状性（t=-0.506，df=65，P=0.614）差异不显著（图4）。
　　2.4 雌雄判别结果
　　利用典型判别分析（canonical discriminant analysis）建立4个Fisher判别函数，在判别分析中用到3个。其中第1个函数的贡献率为93.6%，第2个函数的贡献率为4.7%。从最终的分类结果来看，会出现左右翅相互误判现象。其中，左前翅的分组正确率（86.85%）明显高于右前翅（67.55%）。但雌雄两性间无误判现象（100.00%），其分组散布图如下（图5）。
　　2.5 翅脉交叉点空间位置变化
　　通过普氏叠加和相对扭曲分析发现，所研究的样本无论是雌性或是雄性，翅脉交叉点在翅膀横向上的变化较大，且外围两个翅脉交叉点变异最大。通过相对扭曲分析，绝大部分样本翅脉内部交叉点的变异不大，有部分样本（雌性5个，雄性4个）存在较大变异。雌雄作为两个数据集进行分析时，差异变化最大的翅脉交叉点为标号5和6两个点（图6）。
　　3 结论与讨论
　　通过上述分析，本研究认为重阳木斑蛾成虫左右前翅在轮廓特征上无显著差异，雌雄间存在显著差异。其中，仅利用左前翅的10个轮廓特征参数进行比较时，翅面积、短轴长度、等效圆半径、偏心率、球状性和圆形度在两个性别间的差异达到极显著水平，周长和长轴长度的差异达到显著水平，而紧凑度和叶状性的差异不显著。利用两侧前翅的数据集时，除紧凑度和叶状性的差异不显著外，其余参数均达到极显著水平。虽然利用左前翅的数据集在进行判别分析时分组正确率达到86.85%，且显著高于右前翅的正确率（67.55%），存在左右翅误判的情况，但整体数据集对雌雄无误判现象。雌性或雄性个体间在翅脉交叉点空间位置上的变化多发生在相对于翅的横向方向，且外缘附近的变异更大。
　　在研究过程当中，最初使用未去除鳞片的翅，但在图像获取时鳞片容易脱落，污染背景，且无法准确获取翅脉交叉点位置，利用化学方法去除鳞片[20]是获取鳞翅目昆虫翅脉的关键一步。但这种方法的缺点是只适用于普通昆虫标本，而对于珍稀标本，建议使用其他非破坏性操作方法，如微型计算机断层成像技术（microcomputed tomography）[21]等。
　　本研究结果认为从前翅的轮廓特征来看，同一性别个体间无显著差异，仅利用这些特征可以对重阳木斑蛾成虫进行雌雄区别，并且可以左右翅相互替换。从实际的测量值（平均值±标准误）来看，雌雄间双侧前翅的面积[♀：（227.92±4.085）mm2;♂：（185.23±2.84）mm2]、周长[♀：（84.26±1.24）mm;♂：（77.41±0.85）mm]、长轴长度[♀：（27.19±0.28）mm;♂：（25.56±0.24）mm]、短轴长度[♀：（11.35±0.11）mm;♂：（9.77±0.08）mm]、等效圆半径[♀：（8.51±0.08）mm;♂：（7.67±0.06）mm]存在显著差异，在这些指标上雌性大于雄性，这支持了参考文献[46]中的描述。 　　而从翅脉交叉点的空间分布来看，不但雌雄间存在较大差异，同一性别不同个体间也存在显著差异，主要表现在相对于翅的横向方向的变化，并且靠近外缘的翅脉交叉点位置变化大。许多标本中会出现翅脉交叉点位置缺失或多出，因此所选翅脉交叉点相对位置有很大变化。据报道，在一些膜翅目和双翅目昆虫中，翅脉交叉点位置的相对变化是评价其不同亚种或近似种的重要依据[11， 2223]。而在一些水生昆虫中，不良的环境条件和杀虫剂很可能影响到昆虫左右对称性[24]。本研究采集标本之前，采集地从未使用杀虫剂进行防治，基本可以排除杀虫剂对重阳木斑蛾成虫翅形的影响。根据相关报道，鳞翅目昆虫翅脉交叉点的空间变异，可以用于区别不同夜蛾科昆虫[19]，但是否适用于所有鳞翅目或其他种类的昆虫，能否形成適合绝大多数昆虫的标准化数据库，这些还需要做进一步的研究。
　　在鳞翅目昆虫的饲养和应用当中，尤其是对蝴蝶雌雄的判别方面，除了专业的分类人员可以通过生殖器结构、体和翅正反面彩色鳞片和鳞毛的差异等特征进行鉴别外，大部分工作人员很难准确判断。对于研究中的重阳木斑蛾成虫来说，雌雄间除了翅的形态特征可用于数字化鉴定外，通过腹末生殖节形态也可以做出较准确的判断。一般情况下雌性产卵器为管状外伸，而雄性腹部末端较平截（图1）。另外，雌虫腹部成对的黑斑多相连，而雄性腹部成对的黑斑多分离。但对于其他鳞翅目昆虫来说，这些并不是稳定的鉴定特征。如果能够通过翅的形态特征区别此类昆虫的种类和雌雄，将有利于此类昆虫的数字化鉴定，形成标准化的数据库，推动鳞翅目或其他昆虫种类的远程鉴定功能。
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　　（责任编辑：田 喆）
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