酶-超声波法提取桑葚中花青素及其稳定性的研究
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【摘 要】 优化酶-超声波法提取桑葚中花青素的工艺参数并对其稳定性进行研究。采用超声波提取功率、纤维素酶添加量、提取时间和固液比进行工艺研究。运用光照、温度、金属离子等对其稳定性进行研究。确定最佳提取工艺条件为超声波提取功率180W，纤维素酶添加量8mg/g，提取时间25min，固液比1：20g/mL。花青素对光热敏感，H2O2和Fe3+对其稳定性影响较大，糖对其稳定性基本无影响。该研究可为桑葚花青素的工业化生产、储存提供科学依据。
【关键词】 桑葚 ;花青素;超声波法;稳定性
[Abstract] Optimization of Enzyme - Ultrasonic Extraction of Anthocyanin from Mulberry and Its Stability. Ultrasonic extraction power， cellulase addition， extraction time and solid-liquid ratio were used to study the technology. The stability of light was studied by using light， temperature and metal ion. The optimal extraction conditions were as follows： ultrasonic extraction power 180W， cellulase addition amount 8mg / g， extraction time 25min， solid - liquid ratio 1： 20g / mL. Anthocyanins are sensitive to light and heat， and H2O2 and Fe3+ have a great effect on its stability.
[Keywords] mulberry;anthocyanin;ultrasonic method;stability
桑葚，又叫烏椹、桑椹子、桑枣等，为桑树的成熟果实。桑葚在食用方面可以为人体提供多种营养，同时含有的芦丁、花青素等活性物质也可以作为药材使用。是第一批由国家卫生部认定为“药食同源”的药用植物[1]。花青素是桑葚中重要的营养成分，又称花色素。它是一种水溶性色素，广泛存在于植物中[2]。经过对花青素的研究发现：花青素可以通过清除人体内自由基，达到抗衰老、防止细胞发生突变，抗癌的作用[3，4]。目前，桑葚花青素提取方法有树脂法、水提取等方法。但具有提取率低，时间长等缺点。本实验采用酶-超声波联合提取的方法，利用酶能将大分子物质分解，用纤维素酶对细胞进行破壁，结合超声波高速振动击碎和搅拌的作用，提高了花青素的溶出率[5，6]，从而大大降低提取时间，增加其提取效率，为桑葚在食品和药材方面的利用和开发提供了参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
桑葚：购自浙江省安吉县，经吉林农业大学杨世海教授鉴定为桑科桑属桑种的干燥果实。
1.2 试剂
纤维素酶（30 U/mg）、pH试纸、95%乙醇、浓盐酸、葡萄糖、醋酸钠、氢氧化钠、山梨酸钾、三氯化铁、氯化钾、硫酸铜、亚硫酸钠、氯化钠、蔗糖、氯化镁、过氧化氢、硝酸铝（以上均为分析纯）。
1.3 方法
1.3.1 实验方法 将桑葚在60℃下烘干，将桑葚粉碎成粉末。精密称取2g桑葚粉末。加入酶和提取剂（0.1% HCl 溶液 ： 95%乙醇=1 ： 1），放入超声波提取器里提取一定时间，取出后在转速为5000 r/min的离心机下离心15 min。取上清液，定容到液体最初体积。取1mL液体各至9mL 的pH4.5和pH1.0缓冲液中，放置 40min后在700nm和510nm处分别测定吸光度。
分别选取提取功率、纤维素酶添加量、提取时间和固液比4个因素进行单因素实验，考察各因素对桑葚花青素提取的影响，确定正交试验因素及水平。
1.3.2 花青素提取率的测定方法 pH 的变化不会使干扰的物质发生光谱变化，而花青素会随其产生变化。因此，pH 示差法是一种检测花青素含量的良好方法。通过文献发现，pH示差法的曲线相关系数为0.9935[12]。
1.3.3 酶对花青素得率的影响 按“1.4.1”的方法在固液比为1：20，120W、25℃的条件下超声波振荡20 min，一份加入纤维素酶量6mg/g，另一份不加纤维素酶的条件下进行实验。结果取三次实验平均值。由结果可知，加入纤维素酶使其花青素得率增加。说明纤维素酶可以提高花青素的溶出率。因此，用酶与超声波结合的方法能够提高桑葚花青素的含量。
分析桑葚花青素在变换温度、氧化剂、防腐剂、糖、等条件下保存率的变化。来研究桑葚中花青素在以上几个因素影响下的稳定性。各组实验重复三次。
2 结果与分析
2.1 桑葚花青素提取单因素实验结果
2.1.1 提取功率对花青素得率的影响 结果所示，花青素得率随着提取功率的增大而增加。当提取功率为180 W时，花青素得率最大。功率为210W时，花青素含量出现下降趋势。因为太大的功率使提取环境的温度升高，从而降解了部分桑葚花青素。
2.1.2 纤维素酶添加量对花青素得率的影响 结果所示，花青素得率随着纤维素酶添加量的增大而增加。当添加量达到8mg/g后，增加酶的量，花青素的得率基本不变。由于酶与桑葚粉末已经反应完全，桑葚中花青素已完全溶出。 2.1.3 提取时间对花青素得率的影响 结果所示，在超声振荡15～20min时，花青素的含量随振荡时间的增加而增大。继续增大振荡时间，花青素含量基本不变。因为桑葚粉末与酶在一定时间已经反应完全，花青素不会因为时间而继续溶出。
2.1.4 固液比对花青素得率的影响 结果所示，花青素得率随着固液比的增大而增加。当固液比为1：20时，花青素含量最大。固液比在1：20～1：30的范围内，花青素得率出现了下降趋势。因为大量的溶剂使酶的浓度降低，从而降低了花青素的提取率。
2.2 正交试验结果
2.2.1 正交试验结果 由结果可知，提取时间对试验影响很小;固液比对试验的影响最大。将得到的单因素的最佳条件，与正交试验中得到的最佳提取条件下的提取率作对比，发现其最佳提取条件为A2B2C3D2，即超声波提取功率180 W，纤维素酶添加量8 mg/g，提取时间25 min，固液比1：20 g/mL，花青素得率达到0.352%。
2.3 稳定性实验结果
2.3.1 温度对花青素稳定性的影响 由结果可知，在4℃下保藏的桑葚花青素的保存率最高。桑葚花青素的保存率随温度的升高缓慢降低。在80℃下保藏的桑葚花青素随着时间增加保存率急剧下降。这说明高温对桑葚花青素有降解作用，因此低温有利于桑葚花青素的保存。
2.3.2 光照对花青素稳定性的影响 由结果可知，在黑暗处放置的桑葚花青素保存率基本保持不变;在室内灯光下桑葚花青素随着时间的增加保存率逐渐减小;在紫外灯照射下保藏的桑葚花青素的保存率随时间的延长而急剧下降。说明黑暗环境对桑葚花青素的保存率影响较小，因此避光有利于桑葚花青素的保存。
2.3.3 金属离子对花青素稳定性的影响 由结果可知，加入A13 +、Na+、Mg2+的桑葚花青素的保存率无明显变化，加入Cu2 +的桑葚花青素的保存率稍有降低，而加入Fe3+的桑葚花青素的保存率急剧下降。这说明Fe3+对桑葚花青素的稳定性影响很大，这可能由于Fe3+与桑葚花青素形成金属螯合物，故在生产过程和储存时避免与铁器接触。
2.3.4 氧化剂还原剂对花青素稳定性的影响 由结果可知，加入各种浓度的H2O2的桑葚花青素的保存率都下降明显，保存率最低达到25.1%，这说明H2O2的存在下桑葚花青素的稳定性极差。这可能由于H2O2进攻桑葚花青素的C位，使桑葚花青素生成查耳酮而发生进一步降解。由结果可知，加入亚硫酸钠的桑葚花青素随着时间的增加保存率稍有降低。这说明亚硫酸钠对桑葚花青素的保存率有所影响，但影响不大。
2.3.5 防腐剂对花青素稳定性的影响 结果可知，加入山梨酸鉀的桑葚花青素的保存率基本保持不变。
2.3.6 糖对花青素稳定性的影响 结果可知，加入葡萄糖和蔗糖的桑葚花青素的保存率基本保持不变。
3 结论
通过正交试验结果可知影响桑葚花青素的提取的因素顺序依次为固液比>提取功率>纤维素酶添加量>提取时间，确定了桑葚花青素最佳提取工艺条件为超声波提取功率180 W，纤维素酶添加量8 mg/g，提取时间25 min，固液比1：20 g/mL，此时花青素的提取率为0.352%。桑葚花青素稳定性试验表明， 桑葚花青素对光、热敏感，应在低温避光条件下保存;H2O2能够进攻桑葚花青素的C位使花青素发生降解，Fe3+与桑葚花青素形成金属螯合物，因此H2O2和Fe3+对桑葚花青素的稳定性很大，使用和储存过程中应该避免;糖对桑葚花青素的稳定性基本无影响。
参考文献：
[1] 于萍，赵煜，于长青等.沙棘紫苏油软胶囊降血脂功能保健食品的研制[J].中国食物与营养，2013，（08）：52～55.
[2] 史玉敏，陈洪国，严恒.丹桂中花青素提取工艺的优化[J].咸宁学院学报，2011，31（4）：27～28.
[3] 李双伶，郭俊凌，杜晓.茶树紫色芽叶中花青素的提取—层析分离鸡初步鉴定[J].安徽农业科学，2009，37（28）：13799- 13802.
[4] 江岩.新疆药桑葚花青素延缓衰老作用的研究[J].卫生研究，2010，39（4）：451-～453.
[5] 张琳，李力，杨灿灿等.酶-超声波联合提取紫薯中花青素的研究[J].安徽农业科学，2014，42（35）：12665-12666.
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