一种提高古龙酸大菌的产酸方法

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　　[摘要]目的：利用紫外线改变DNA的分子结构的方法对生产古龙酸的大茵进行诱变选育来获得高产菌株。方法：以大菌CX75001为出发菌株通过紫外诱变的方法改变生产茵株的遺传性特征以此来提高古龙酸代谢山梨糖的能力使其酸值产量提高，并利用96孔板发酵结合快速酸值测定进行高通量筛选。结果：诱变时间60s时诱变菌株产酸量有较大幅度提高。通过三轮复筛验证最终获得7株产量分别比出发菌株提高了47.78%，46.67%，38.89%，45.56%，48.89%，43.33%，42.22%的突变菌株。结论：利用紫外诱变可以提高大菌的产酸量。
　　[关键词]紫外诱变;产酸增强;遺传性改变;高通量筛选
　　古龙酸作为维生素C的中间体原料"，VC又称抗败血酸，以医用为主，周期性较弱，全球需求约15万吨。VC具有天然抗氧化性质，下游可用于食品、医药、保健品及饲料添加剂等领域，以食品饮料添加剂为主，受淡旺季影响较小，周期性不强。而古龙酸的是一种微生物发酵产品，其发酵技术门槛有很大的限制，选育优良的菌种以提高发酵生产古龙酸的酸值，无形中降低的是古龙酸发酵的成本。
　　维生素C又名抗坏血酸，在体内参与多种反应，如参与氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。因此，当维生素C缺乏所引起的坏血病时，伴有胶原合成缺陷，表现为创伤难以愈合，牙齿形成障碍和毛细血管破损引起大量淤血点，淤血点融合形成淤斑。具有抗组胺作用及阻止致癌物贡亚硝胺生成的作用。
　　1材料与方法
　　1.1菌株
　　古龙酸生产菌：大菌CX75001
　　1.2培养基
　　斜面培养基（w/v）：酵母浸粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.1%，琼脂1.5%;
　　Ph值自然;
　　96孔板高通量筛选培养基参照文献B）;
　　摇瓶种子培养基（w/v）：蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，葡萄糖0.5%;
　　摇瓶发酵培养基（w/v）：山梨糖5%，酵母浸粉1%，蛋白胨2%，丙三醇0.8%，氯化钠0.3%，硫酸镁0.15%，磷酸二氢钾0.1%;
　　Pu值自然。
　　2高产菌株的诱变和筛选
　　2.1孢子菌悬液制备
　　在无菌室取一支无杂菌的斜面，将孢子刮人到灭好的种子培养基中，30度250r/min震荡培养8小时，使其菌落数在4*10^7个/ml。
　　2.2紫外诱变
　　取萌发好的孢子菌悬液10ml置于无菌培养皿中，用30w的紫外照射仪于20em高度处垂直照射，设定诱变时间分别为10s，20s，30s，60s，90s，取100ul孢子菌悬液涂平板，每个梯度设置3个重复，30度，48h。
　　2.3高通量筛选方法
　　本实验建立了96孔板发酵培养高通量筛选方法。96孔板发酵培养条件参，照文献图，按照常规的涂平板法分离单菌落，挑选饱满的单菌落在96孔板中进行培养，将培养好的发酵液，测定其酸值。选取产量提高的菌株进行摇瓶复筛验证，复筛验证时每个菌株设置3个重复。
　　2.4結果与分析
　　2.4.1菌落数量统计
　　2.4.2酸值测定
　　从发酵复测的结果可以看出，酸值的偏差不大，可以确定这七株大菌其生物遗传性相对稳定。虽然酸值得到了一定程度的提高，分别得到提高了47.78%，46.67%，38.89%，45.56%，48.89%，43.33%，42.22%的突变菌株。
　　3结果与讨论
　　本实验利用在紫外照射距离d=20cm，诱变时间为60s的情况下对古龙酸大菌的诱变效果最好。紫外诱变能改变微生物的DNA结构，使遗传基因得到改变。最后筛选到比出发菌株发酵产量提高30%以上的菌株有8株，并通过转接实验验证了这些菌株具有较好的遗传稳定性。
　　4展望
　　古龙酸是生产维生素C的前体物质，VC作为一种大众商品本身利润率就相比较低，降低其成本就能增加产业效益。而VC的用途更是广泛：提高人体的免疫力;抗氧化;参与胆固醇的代谢。可谓市场前景广大，对于这种大众商品只有确保生产厂家的利润，市场才能良性的发展，大众才能买到放心安心的药。
　　[参考文献]
　　[1]百度百科[Z].
　　[2]中国产业信息[Z].
　　[3]中国农业出版社[Z].
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