关于DMSO和BSA对全血DNA扩增的影响研究及对比

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　　摘要：目的为了使在犯罪现场提取的微量有污染的DNA可以被准确检测出来。方法通过使用全血样本，在进行PCR直扩过程中加入DMSO或BSA，并测序后得出最后结果，比较两种试剂的增强效果。结果两种方法都不同程度的提高了DNA的扩增量，使其检出率大大提高了。结论2mg/ml的BSA，0.4mg/ml的DMSO很大程度的提高了DNA的扩增量和检出率。
　　关键词：全血样本;血红素;PCR;STR;DMSO;BSA
　　
　　作為目前法医物证检验鉴定的常规技术，对生物检材中的DNA进行扩增是DNA分型中的一个重要环节，而要使DNA分型能够顺利进行，就必须提高PCR扩增的高效性和灵敏性。在刑事案件现场收集到的DNA检材通常会有一定的污染，其会使检材无法被准确检测出来，这也是PCR扩增失败的主要原因。
　　目前，血液中的血红素已被证实为PCR抑制物之一[1]，而血液作为刑事案件中常见的生物检材，在PCR领域中具有较高的研究价值。当前，国内外学者的大量研究以及法医学的大量实践可证实，一定浓度的DMSO或者BSA可提高DNA扩增量，但超过一定浓度也会导致PCR扩增效率的降低，且它们的浓度数值关系研究得不够清楚。尽管市场上已存在很多全血直扩试剂盒，但由于对相关促进PCR扩增试剂浓度数值关系的不确定，造成其扩增效力也不尽相同。通过本次课题研究，对比出DMSO和BSA对PCR扩增的影响大小，以及各个合适浓度值来作为PCR增强剂。
　　1 材料
　　1.1 检材提取
　　采血前让志愿者洗净双手，并用70%乙醇溶液消毒。用采血器采血后用吸血器吸取，然后滴取在已消毒的滤纸上。标明姓名和时间。
　　1.2 仪器
　　（1）分析天平。
　　（2）移液器。
　　（3）震荡仪。
　　（4）打孔器。
　　（5）纯水仪。
　　（6）高速离心机。
　　（7）7500PCR扩增仪（由美国应用生物系统公司提供）。
　　（8）3500测序仪（由美国应用生物系统公司提供）。
　　1.3 试剂
　　（1）A27plex试剂盒。
　　（2）BSA（10mg/ml）。
　　（3）DMSO（1.1mg/ml）。
　　（4）Taq DNA聚合酶。
　　（5）甲酰胺。
　　（6）Ladder。
　　（7）Liz内标。
　　1.4 主要试剂配制
　　（1）BSA：分别取0.01g、0.02g、0.03g、0.04gBSA于2mlEP管中，加入纯水至2ml。使其浓度依次为5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml。
　　（2）DMSO：取浓度为1.1g/ml的DMSO2ml分装在2mlEP管中。
　　2 实验方法
　　2.1 PCR扩增步骤
　　2.1.1 DMSO实验的扩增前的实验步骤
　　（1）在带有血样的滤纸上标上姓名及采血时间后待其晾干。
　　（2）取0.2mlEP管6个放置于孔板上。
　　（3）用已消毒的打孔器在有血样的滤纸片上打孔（每次一下），将所得血样粒放入0.2mlEP管中，每个EP管中放置两粒。
　　（4）取1个0.2mlEP管放置在孔板上。
　　（5）取24μLMix，12μLPrimer，2.4μLTaq DNA聚合酶于一0.2mlEP管中，并置于震荡器混匀。
　　（6）将最大量程为10μL的移液器调至6.4μL，将（2）中混合液取6.4μL，分装于6个含有血样的0.2mlEP管中。
　　（7）将6个0.2ml1EP管分别标号为HO（对照）、HD0.2、HD0.4、HD0.6、阴性和阳性。
　　（8）然后依次加入3.6μLddH2O、0.2μLDMSO和3.4μLddH2O、0.4DMSO和3.2μLddH2O、0.6μLDMSO和3μLddH2O、3.6μLddH2O、1μL DNA Contral 9947A和2.6μLddH2O。
　　（9）将其放置于高速离心机中以4930rpm速率离心10秒。
　　2.1.2 BSA实验的扩增前的实验步骤
　　（1）在带有血样的滤纸上标上姓名及采血时间后待其晾干。
　　（2）取0.2mlEP管6个放置于孔板上。
　　（3）用已消毒的打孔器在有血样的滤纸片上打孔（每次一下），将所得血样粒放入0.2mlEP管中，每个EP管中放置两粒。
　　（4）取1个0.2mlEP管放置在孔板上。
　　（5）取24μLMix，12μLPrimer，2.4μLTaq DNA聚合酶于一0.2mlEP管中，并置于震荡器混匀。
　　（6）将最大量程为10μL的移液器调至6.4μL，将（2）中混合液取6.4μL，分装于6个含有血样的0.2mlEP管中。
　　（7）将6个0.2ml1EP管分别标号为HO（对照）、HD0.2、HD0.4、HD0.6、阴性和阳性。
　　（8）然后依次加入3.6μLddH2O、0.2μLDMSO和3.4μLddH2O、0.4DMSO和3.2μLddH2O、0.6μLDMSO和3μL ddH2O、36μLddH2O、1μLDNA Contral 9947A和2.6μLddH2O。
　　（9）将其放置于高速离心机中以4930rpm速率离心10秒。
　　2.2 PCR扩增热循环参数 　　（1）95℃预变性2min;
　　（2）94℃10s，60℃1.5min，循环28次;
　　（3）60℃延伸20min;
　　（4）4℃保温。
　　2.3 测序步骤
　　2.3.1 DMSO实验的测序的实验步骤
　　（1）取72μL甲酰胺，1.6μL Liz于0.2mlEP管中，并用移液器吹打若干次。
　　（2）将最大量程为10μL的移液器调至9.2μL，并将（1）中混合液按照顺序以9.2μL分装至96孔板中。
　　（3）顺次加入1μL Ladder，1μL 阳性对照，1μL阴性对照，1μLH0，1μLHD0.2，1μLHD0.4，HD0.6。
　　（4）将孔板盖好后放入平板高速离心离心机中以4930rpm速率离心30秒后取出。
　　2.3.2 BSA实验的测序前的实验步骤
　　（1）取81μL甲酰胺，1.8μL Liz于0.2mlEP管中，并用移液器吹打若干次。
　　（2）将最大量程为10μL的移液器调至9.2μL，并将（1）中混合液按照顺序以9.2μL分装至96孔板中。
　　（3）顺次加入1μL Ladder，1μL阳性对照，1μL阴性对照，1μLH0，1μLHB0.5，1LHB1.0，HB1.5，HB2.0，HB3.0，HB6.0，HB9.0。
　　（4）将孔板盖好后放入平板高速离心离心机中以4930rpm速率离心30秒后取出。
　　3 实验结果
　　由于基因峰值升降趋势大致相同，故随机抽取三对碱基：D7S820，D18S51，D8S1179为例进行数据统计。
　　3.1 DMSO对全血PCR扩增效率影响的实验结果
　　3.1.1 实验数据统计表（如表1所示）
　　3.1.3 实验结果分析
　　根据统计数据可得，当DMSO体积分数为0至4%时，DMSO对全血样本PCR扩增效率随着DMSO体积分数的升高而升高;当DMSO体积分数为4%至6%时，DMSO对全血样本扩增效率随着DMSO体积分数的升高而降低。其中，根据统计图中峰值可判断出DMSO对提升全血样本扩增效率的最适体积分数是在4%，由此得出关于DMSO的一种增强剂为0.4mg/ml的DMSO。
　　3.2 BSA对全血PCR扩增效率影响的实验结果
　　3.2.1 实验数据统计表（如表2）
　　3.2.3 实验结果分析
　　根据统计数据可得，当BSA浓度为0至2mg/ml时，BSA对全血样本PCR扩增效率随着BSA浓度升高而升高;当BSA浓度为3至9mg/ml时BSA对全血样本PCR扩增效率基本进入平台期。其中，当BSA为2mg/ml时全血样本PCR扩增效率最为明显，由此得出关于BSA的增强剂为2mg/ml的BSA。
　　3.3 组间实验结果分析
　　根据表1、2的实验数据，可得当DMSO体积分数为4%、BSA浓度为2mg/ml分别对应提高全血PCR扩增效率的最佳浓度。
　　对于上述统计结果，发现两种不同的增强剂对于不同的基因链条扩增效果的影响不同，但相对于空白组H0都较大程度增加了DNA的扩增量。从局部来看，单独使用BSA（HB2.0）的效果普遍获得的碱基数量针对基因D7S820扩增量是最高的，远远超过DMSO（HD0.4），但对于剩余两组基因单独使用DMSO（HD0.4）要比BSA（HB2.0）扩增所得的碱基数量要高一些，由此无法对比出两者对于PCR反应的影响大小。
　　4 讨论
　　4.1 两种试剂对全血PCR效率影响的实验分析
　　由于本实验采用四色荧光测序，并且根据最终实验结果来看，DNA峰值升降趋势相同，因此以每一组荧光所代表的碱基对为单位，从每一组荧光测序组中随机选择一对碱基进行实验数据统计。
　　4.1.1 对加入DMSO的实验分析
　　DMSO是一种无色无味透明液体，有吸水性，分子式为，见图4。分子含有一个极性非常高的键和两个相同的非极性基团，因此，它既可溶于非极性溶剂又可溶于极性溶中，因为这种物理化学特性，可以作為一些不溶于水的化合物的有效溶剂，并且可以破坏水分子之间的氢键。工业上被用于溶剂和萃取剂。在生物学研究中，它可以作为一个优良的溶剂，而在医药治疗中，它可以作为有效的溶媒介物，因此可以用于PCR整个反应体系使之充分混合，同时DMSO也作为变性剂可直接解除模板DNA的局部二级结构，从而增加引物和模板的特异性结合，降低非特异性结合，最终获得满意的扩增效果。
　　在徐葵，邱志明，汪晓英《DMSO对PCR扩增反应的影响》一文中[3]，受解决δ受体基因屡次失败，从而使用体积分数为6%至13%DMSO时，使其顺利扩增的启发。将预实验中DMSO的体积分数分别定为6%，8%和10%。但实际操作中，用体积分数为6%，8%和10%的DMSO进行实验的实验结果表示，当DMSO体积分数超过6%时，会对全血样本PCR的扩增效率起到抑制作用。因此，以6%的体积分数为界限，研究体积分数为2%，4%，6%时对实验结果的影响。
　　通过对表1和图1的实验数据进行分析可得，当DMSO体积分数为2%至4%时，全血PCR扩增效率逐渐升高，在其体积分数为4%时达到峰值;其体积分数超过4%后，全血PCR扩增效率逐渐降低。可分析出，对A21plex试剂盒而言，当DMSO体积分数小于4%时，可直接接触全血DNA模板的局部二级结构，加强引物和全血DNA模板的特异性结合;当DMSO体积分数大于4%时，DMSO会对Taq DNA聚合酶产生抑制作用。而Taq DNA聚合酶作为PCR扩增所需材料，一旦其失去活性，会导致PCR扩增效率的下降。 　　4.1.2 对加入BSA的实验分析
　　BSA一般做为稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，因为有些酶在低浓度下不稳定或活性低。加入BSA后，它可能起到“保护”或“载体”作用，不少酶类添加BSA后能使其活性大幅度提高。不需要加BSA的酶加入BSA一般不会受到什么影响。对多数底物DNA而言，BSA可以使酶切更完全，并可实现重复切割。在37℃时，酶切反应超过1h时，BSA可以使酶更加稳定，因为在不含BSA的反应缓冲液中，许多限制性内切酶在37℃下只能存活1020分钟甚至更短的时间。而BSA可以结合缓冲液或底物DNA中抑制限制性内切酶活性的金属离子和其它化学物质。BSA同样是酶的稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附，也能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。
　　根据上述性质我们可以得出BSA可以在PCR体系中有助于维持Taq酶的稳定性及活性，可以提高PCR的效率。同样，我们也了解到当反应体系中蛋白浓度低于20μg/μL时，有些酶就会极不稳定。加入BSA后，不仅可以减少蛋白的降解，而且还能减轻非特异性吸附造成的酶蛋白丢失[3]。并且在AlSoud等[3]通过离子交换色谱成像系统和荧光定量PCR仪等来鉴定和纯化人体血细胞内的PCR扩增抑制物成分，结果表明血红蛋白和乳铁蛋白中的9种扩增促进剂中BSA的效果最明显。但是过量的BSA也会与DNA结合而影响DNA的电泳分离[4]。
　　根据本次课题探究所得实验结果：当BSA浓度在0.5至2mg/ml时，随着BSA浓度的升高，全血样本PCR扩增效率不断升高;当BSA浓度超过2mg/ml时，随着BSA浓度的升高，全血样本PCR扩增效率显著降低。可分析，在BSA浓度小于2mg/ml时，随着BSA浓度的升高，其对Taq DNA聚合酶活性稳定的保持作用越强，因此，更好得促进了PCR扩增效率;当BSA浓度超过2mg/ml时，过量的BSA就会与全血样本中的DNA结合[4]，故测序所得DNA峰值降低。
　　4.2 两种试剂对PCR的影响的对比分析
　　在徐葵，邱志明，汪晓英《DMSO对PCR扩增反应的影响》一文中[2]，发现是由于不同基因的碱基对A、G、C、U的比列及数量不同，DMSO本身可作为变性剂可直接解除模板DNA的局部二级结构，即G、C碱基对的化学键，由于其热稳定性较好，加入DMSO后，可以促进其解旋，从而增加引物和模板的特异性结合，降低非特异性结合，但当DMSO的浓度超过一定量的时候，DMSO会对Taq DNA聚合酶产生抑制作用，而Taq DNA聚合酶作为PCR扩增的材料，其活性如果被抑制，会导致PCR扩增效率的下降，因此要控制好DMSO的浓度配比。而对于BSA在酶切反应中，通过提高溶液中蛋白质的浓度，可以对酶起保护作用，以防止酶的分解和非特异性吸附，减轻酶的变性，随着BSA浓度的升高，其对Taq DNA聚合酶活性稳定的保持作用越强，但当BSA浓度超过一定限度时，过量的BSA就会与全血样本中的DNA结合，故会导致DNA的扩增量减少，因此也应控制好BSA的浓度配比。两者进行比对后发现在DNA扩增过程中的作用各不相同，整体来看，两者在不同浓度配比时对PCR反应过程中各有不同的影响。单独看两者的最佳浓度，对于DMSO，当整个体系浓度为0.4mg/ml时，对PCR的增强效果最佳;对于BSA，当整个体系浓度为2mg/ml时，对PCR的增强效果最佳。
　　4.3 实验中遇到的问题及解决方法
　　实验过程中，有几组实验结果出现污染较大的问题。经排查，发现是受移液器针头中气溶胶的影响。在打开操作台紫外灯消毒后，污染问题已解决。
　　5 结论
　　（1）在探究DMSO对全血样本PCR扩增效率影响的实验中，当DMSO体积分数为4%时，对全血样本PCR扩增效率的促进作用最大。
　　（2）在探究BSA对全血样本PCR扩增效率影响的实验中，当BSA浓度为2mg/ml时，对全血样本PCR扩增效率的促进作用最大。
　　（3）以上两组实验发现DMSO和BSA两者对PCR反应的影响都各有不同，但都很大程度上增加了DNA的扩增量。通过此次实验，发现0.4mg/ml的DMSO有最佳的增强效果，2mg/ml的BSA有最佳增强效果，但无法对比出哪一种试剂最为适合做PCR增强剂，一方面要根据被测试者的基因特点，另一方面要看提取的污染程度和血液中蛋白质和血红素的含量，因此无法对比出BSA和DMSO哪种试剂对DNA扩增的影响最大。
　　参考文献：
　　[1]Lantz P G Matsson M，Wadstrom T，etal.Removal of PCR inhibitors from human fecal samplesthrough the use of an aqueous twophase system for sample preparation prior to PCR[J].Journal of Microbiological Methods，1997，28（3）：159167.
　　[2]徐葵，邱志明，汪曉英.DMSO对PCR扩增反应的影响[J].昆明医学院学报，2001，（1）：7779.
　　[3]AlSoud W A，Radstrom P.Purification and characterization of PCR inhibitory components in boold cells[J].Journal of clinical microbiology，2001，39（2）：485493.
　　[4]Sankarganesh Murugesan，Dhaveethu Raja Jeyaraj，Sakthikumar Karunganathan，Solomon Rajadurai Vijay，Rajesh Jegathalaprathaban，Athimoolam Shanmuganarayanan，Vijayakumar Vijayaparthasarathi.New biosensitive and biologically active single crystal of pyrimidine scaffold ligand and its gold and platinum complexes：DFT，antimicrobial，antioxidant，DNA interaction，molecular docking with DNA/BSA and anticancer studies.[J].Bioorganic chemistry，2018，81.
　　作者简介：李雨衡（1999），女，汉族，湖北京山人，就读于湖北警官学院侦查系，研究方向：侦查学。
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