双丙酮丙烯酰胺改性海藻酸盐对GP-CS可注射水凝胶温敏性能的影响

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　　摘   要：本文采用自由接枝共聚法，以过硫酸钾为引发剂，双丙酮丙烯酰胺（DAAM）改性的海藻酸钠（SA），制得海藻酸钠-双丙酮丙烯酰胺（SA-DAAM）共聚物，与壳聚糖（CS）、β-甘油磷酸钠（GP）共混在37 ℃中温敏相变后，形成GP-CS-SA-DAAM复合水凝胶。同理，将GP-CS与未改性的海藻酸钠（SA）共混制成一系列的GP-CS-SA复合水溶胶，考察物料比（GP-CS与SA质量比;GP-CS与SA-DAAM質量比）对复合凝胶于37 ℃中凝胶化时间、复合凝胶微观形貌、热稳定性、平衡溶胀率和降解性能的影响。结果表明：GP-CS-SA-DAAM复合凝胶较GP-CS-SA复合凝胶凝胶化时间短，微观孔隙结构更发达，二者之间的热稳定性无显著差异。GP-CS-SA-DAAM复合凝胶的平衡溶胀率低于GP-CS-SA复合凝胶，而残留率高于GP-CS-SA复合凝胶，说明GP-CS-SA-DAAM复合凝胶较GP-CS-SA复合凝胶更具有可注射优势。
　　关键词：双丙酮丙烯酰胺  海藻酸钠  壳聚糖  水凝胶  温敏性能
　　中图分类号：TQ460.1                              文献标识码：A                        文章编号：1674-098X（2019）11（c）-0103-07
　　Abstract： Copolymer sodium alginate-Diacetone acrylamide（SA-DAAM） was prepared by graft copolymerization，by using potassium persulfate as the initiator and using diacetone acrylamide（DAAM） to hydrophobically modify sodium alginate（SA）. A kind of composite thermo-sensitive GP-CS-SA-DAAM hydrogel was prepared by at 37℃ using chitosan （CS） and sodium glycerophosphate （GP） ，blended with SA-DAAM. Meanwhile， a kind of composite thermo-sensitive GP-CS-SA hydrogel was prepared by at 37℃ using chitosan （CS） and sodium glycerophosphate （GP） ， blended with SA. The effects of material ratio（the mass ratio of GP-CS and SA; the mass ratio of GP-CS and SA-DAAM）on gelation time， micromorphology， thermal stability， equilibrium swelling and degradation performance were investigated. The GP-CS-SA-DAAM composite gel had shorter gelation time than GP-CS-SA composite gel. The microscopic pore structure of GP-CS-SA-DAAM composite gel was more developed than GP-CS-SA composite gel. Moreover，the thermogravimetric analysis showed that there was no significant difference between the thermal stability of GP-CS-SA-DAAM composite hydrogel and GP-CS-SA composite hydrogel. The equilibrium swelling ratio of GP-CS-SA-DAAM composite gel was lower than that of GP-CS-SA composite gel. The residual ratio of GP-CS-SA-DAAM composite gel was higher than GP-CS-SA composite gel.The GP-CS-SA-DAAM composite gel was more injectable than the GP-CS-SA composite gel.
　　Key Words： Diacetone acrylamide; Sodium alginate; Chitosan; Hydrogelsl; Temperature-sensitivity
　　干眼症是种常见的眼科疾病，表现为眼部干涩，伴随着异物感且畏光不适等[1-3]。眼用凝胶制剂具有非常独特的溶胶-凝胶相变性能，可有效延长药物与眼球表面的接触时间，增强药物在角膜的通透性，达到提高眼部生物利用度的效果，是适合用于眼部给药的良好载体[3]。而壳聚糖-甘油磷酸盐（GP-CS）是一种可对对外界温度刺激产生敏感响应，当外界温度变化时，水凝胶立即发生不持续突变，使溶液在某一范围内出现相转变形成凝胶的现象[4-5]。GP-CS溶液在人体的体温温度以下时为流动液体状态，当温度接近于人体的温度时则转变为凝胶状态，并且具有良好的可降解性、可注射性、生物组织相容性和无毒副作用[6]。本项目利用CS与GP可在37℃发生温敏相变形成凝胶的特性，采用生物相容性优良海藻酸钠（SA）、双丙酮丙烯酰胺改性海藻酸钠（SA-DAAM）为共混材料，改善CS-GP凝胶存在温敏相变时间较长，机械强度差，易于溶胀和降解，热稳性差等问题，对CS-GP溶胶的凝胶化速率、凝胶机械强度、膜孔径等性能进行调控。 　　1  实验部分
　　1.1 实验试剂
　　壳聚糖（CS，脱乙酰度>95.0%），海藻酸钠（SA，粘度>400mPa.s），双丙酮丙烯酰胺（DAAM，纯度为99%），均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;β-甘油磷酸钠（β-GP，纯度为98%），购于上海麦克林生化科技有限公司;碳酸氢钠;过硫酸钾;无水氯化钙;氯化钠;氯化钾;盐酸;氢氧化钠;纯度均为AR，均购于成都市科龙化工试剂厂。
　　1.2 双丙酮丙烯酰胺改性海藻酸钠的合成
　　利用自由基接枝共聚法[7]，以过硫酸钾为引发剂，使海藻酸钠的-OH产生自由基，与双丙酮丙烯酰胺的-C=C-发生反应，制得海藻酸钠-聚双丙酮丙烯酰胺共聚物，具体实验步骤如下：称取3.00g的海藻酸钠，放入装有300mL蒸馏水的圆底烧瓶中，常温下磁力搅拌1h，使海藻酸钠充分溶解。再称取3.60g双丙酮丙烯酰胺投入上述溶液中，继续搅拌30min，然后加入9 mL 2g/L过硫酸钾继续搅拌30min，置于90℃中持续搅拌反应3h，反应完全后得到乳白色溶液。冷却后将其装入规格为（Mw：8000-14000）的透析袋中用蒸馏水透析，每日更换蒸馏水3～4次，透析7d，透析完成后进行冷冻干燥，得到白色产物双丙酮丙烯酰胺改性海藻酸钠（SA-DAAM）。
　　1.3 GP-CS、GP-CS-SA和GP-CS-SA-DAAM复合水凝胶的制备
　　（1）称取2.20 g壳聚糖（CS）溶于100 mL 0.1 mol/L 稀盐酸中（盐酸现用现配），搅拌2h使壳聚糖充分溶解，制备得到2.2% （w/v）壳聚糖盐酸溶液，将其置于4 ℃处冷藏备用。
　　（2）称取3.50 g β-甘油磷酸钠（GP）并溶于6.25mL蒸馏水中，制备得56%（w/v） GP水溶液。将GP水溶液缓慢滴入（1）中壳聚糖盐酸溶液，调pH=7.2±0.02，冰浴条件下搅拌30 min，得到GP-CS溶胶，将其置于4 ℃处冷藏备用。
　　（3）将2.00g双丙酮丙烯酰胺改性的海藻酸钠（SA-DAAM）溶于100mL蒸馏水中，充分溶解后得到2% （w/v）的SA-DAAM溶液。
　　（4）将一定量SA、SA-DAAM溶液边搅拌边缓慢滴入上述的GP-CS溶胶中，冰浴搅拌30 min。GP-CS溶胶与SA溶液、GP-CS溶胶与SA-DAAM溶液均按质量比为8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8进行混合，冰浴搅拌完成后得到不同质量比的GP-CS-SA水溶胶、GP-CS-SA-DAAM复合水溶胶。
　　（5）将（2）、（4）配制的溶胶分别倒入模具中并置于37℃水浴中进行凝胶化反应，制得GP-CS水凝胶、GP-CS-SA复合水凝胶、GP-CS-SA-DAAM复合水凝胶。
　　1.4 测试与表征
　　1.4.1 SA-DAAM红外表征及接枝率的计算
　　Spectrum RX/BX型傅里叶红外变换光谱仪（美国Perkin Elmer公司）：扫描范围4000-500cm-1，将冷冻干燥好的原料药品，采用溴化钾压片法制备待测样品（SA，SA-DAAM），将待测样品固定在样品架上，采用傅里叶变换红外光谱仪进行检测。
　　接枝率D%的计算公式如式：
　　（1）
　　式中，M1为SA-DAAM的质量（g），M2为SA的质量（g）。
　　1.4.2 溶胶-凝胶相转化时间的测试
　　将2mL GP-CS溶胶、GP-CS-SA溶胶、GP-CS-SA-DAAM混合溶胶注入玻璃试管中，置于37℃恒温水浴，开始计时。每隔10 s将试管取出后，倾斜并观察试管中溶胶的流动状况，当倾斜试管时溶胶并无流动行为，则记录下时间，为溶胶-凝胶化的时间。平行测定3次，计算平均值。绘制出GP-CS-SA、GP-CS-SA-DAAM复合凝胶随SA、SA-DAAM浓度的相转变时间曲线。
　　1.4.3 复合凝胶的红外表征
　　Spectrum RX/BX型傅里叶红外变换光谱仪（美国Perkin Elmer公司）：扫描范围4000-500cm-1，将冷冻干燥好的复合凝胶与干燥好的原料药品，采用溴化钾压片法制备待测样品（CS，GP，SA，SA-DAAM，GP-CS，GP-CS-SA，GP-CSSA-DAAM），将待测样品固定在样品架上，采用傅里叶变换红外光谱仪进行检测。
　　1.4.4 复合凝胶的形貌表征
　　EV018型扫描电子显微镜（德国ZEISS SIGMA）：将冷冻干燥好的复合水凝胶切取横截面，对其表面进行喷金后，采用德国ZEISS SIGMA的电子显微镜进行扫描观察并记录，表征凝胶截面的微观形貌。
　　1.4.5 复合凝胶的热稳定性测定
　　HQT-4型全自动热差分析仪（北京恒久科学仪器厂）：采用热重分析仪对GP-CS-SA、GP-CS-SA-DAAM复合凝胶进行热分析。在N2保护下实验的温度范围为20℃～600℃，以10℃/min升温速率测试复合凝胶质量损失;
　　1.4.6 复合凝胶的平衡溶胀测定
　　（1）模拟泪液配制[8]：精确称量2.18g碳酸氢钠，0.06g无水氯化钙，6.78g氯化钠，1.38g氯化钾，溶于蒸馏水中，用现配的0.1 mol/L氫氧化钠或0.1 mol/L稀盐酸调节溶液至pH=7.4，定容至1 L。
　　（2）将复合溶胶倒于自制的大小相同模具中，置于37 ℃中水浴加热，使其溶胶转变为凝胶后，将取出的凝胶，分别浸泡在37℃的模拟泪液中，每隔一段时间后，取出模拟泪液中溶胀后的凝胶，用滤纸吸走凝胶表面的水分，采用精密度为（0.0001g）的分析天平进行凝胶质量的称量。平衡溶胀率（ESR）用公式（2）表示。 　　（2）
　　式中W1与W2分别是凝胶浸泡在模拟泪液后的质量与凝胶未浸泡在模拟泪液中的质量。
　　1.4.7 复合凝胶的降解测定
　　将复合溶胶倒于自制的大小相同模具中，置于37℃水浴加热，使其溶胶转变为凝胶后，将取出的凝胶记初始质量记为M0。将取出的凝胶放入37℃模拟泪液中，每隔24h取出凝胶，用滤纸吸走凝胶表面的水分，称量复合凝胶的质量，记为Mt。。以公式（3）表征复合凝胶的降解率，每个浓度平行测定3次。
　　（3）
　　2  结果与讨论
　　2.1 SA、SA-DAAM的红外表征分析
　　图1中，在SA光谱图中，3436.02cm-1处为-OH的伸缩振动峰，1618.90cm-1与1404.42cm-1分别是羧基的不对称和对称伸缩振动峰。1031.84cm-1是C-O的伸缩振动峰。与SA的红外光谱相比，SA-DAAM光谱图上多了1648cm-1处的C=O伸缩振动峰，在 3374.77cm-1处为-NH-的吸收峰，说明SA与DAAM之间发生了反应，DAAM分子成功接枝上SA的侧链。
　　2.2 SA-DAAM接枝率的计算
　　根据接枝率公式（1）计算，海藻酸钠投入量为3.00g，双丙酮丙烯酰胺投入量为3.60g，过硫酸钾投入量为9mL，且反应温度为90 ℃时，双丙酮丙烯酰胺改性海藻酸钠的接枝率达到了66%。
　　2.3 SA-DAAM与SA对GP-CS溶胶相转化时间的作用
　　表1所示，当CS浓度为2.20%（w/v）、GP浓度为56%（w/v）、CS与GP水溶液体积比为16∶1时，溶胶发生凝胶化反应所需时间为660s。在pH=7.2，CS侧链链上存在-OH和-NH3+，GP链上存在-OH和PO43-。常温条件下，将CS溶液与GP溶液混合时，CS链上-NH3+、GP链上-OH与水分子形成强烈氢键，减弱了CS链上-NH3+与GP链上PO43-的静电作用力。当体系温度升高至37℃时，CS与H2O、GP与H2O分子间氢键部分断裂，同时相对分子质量为198的GP在CS分子网络中扩散系数增大，增强了GP链上PO43-与CS 链上-NH3+间静电作用力，溶胶从无序状态变为有序结构的凝胶态[8]。在此基础上，文中采用SA及SA-DAAM对GP-CS 溶胶的凝胶化速率进行调控。当W（GP-CS）：W（SA）由8：2上升到5：5时，溶胶在37℃恒温水浴中凝胶化时间由120s缩短至30s，这是因为随着体系SA含量增大，SA分子链COO-增多，与CS链上-NH3+结合率增大，缩短凝胶化时间[9]。当W（GP-CS）：W（SA-DAAM）由8：2上升到5：5时，溶胶在37℃恒温水浴中凝胶化时间由90s缩短至15s，这是因为随着体系SA-DAAM含量增大，SA-DAAM分子链COO-增多，与CS链上-NH3+结合率增大，缩短凝胶化时间。15S的相变时间既能为泪道栓塞术提供所需的注射操作时间，又能保证进入泪道的溶胶快速转变为凝胶。
　　2.4 CS、GP、GP-CS、GP-CS-SA和GP-CS-SA-DAAM的红外图谱分析
　　在CS的红外图谱线上，3651-3041cm-1处，是醇羟基伸缩振动峰与胺基伸缩振动峰重叠而增宽的多重伸缩振动吸收峰，2877.71cm-1处是C-H的伸缩振动吸收峰。在1599.51cm-1，1384.75 cm-1，1155.13cm-1和1094.93cm-1处分别是-NH2的面内弯曲伸缩振动峰，C-CH3的对称变形伸缩吸收峰，环上C-O伸缩振动吸收峰和醇羟基的变角振动峰。在GP的红外光谱上，3430.62cm-1处为-OH的伸缩振动峰，1075.37cm-1处是磷酸根的不对称伸缩振动峰，而950.80cm-1处是磷酸根的对称伸缩振动峰。
　　在GP-CS光谱图上，-OH和-NH的重叠峰从3430.62cm-1变成了3415.84cm-1，表明GP分子中的醇羟基与CS分子中的胺基发生了相互作用。而C=O伸缩振动峰从1717.22cm-1红移至1663.23cm-1，且-NH的变形伸缩振动峰由1599.51cm-1红移至1538.28cm-1，表明了CS分子上的胺基与GP分子上的磷酸根发生静电络合反应。GP-CS-SA的红外光谱图上出现了CS、GP和GP-CS的所有特征吸收峰。与SA图谱相比，GP-CS-SA复合凝胶中海藻酸钠的O-H变形振动吸收峰、C=O伸缩振动吸收峰和C-O伸缩吸收峰均减弱，说明复合凝胶中海藻酸钠分子上的-COO-与壳聚糖分子上的-NH3+发生了离子间的静电结合。GP-CS-SA-DAAM的红外光谱上都出现了CS、GP和GP-CS的所有特征吸收峰。与SA-DAAM光谱相比，GP-CS-SA-DAAM复合凝胶中的O-H变形振动吸收峰减弱，C=O伸缩振动吸收峰和C-O伸缩吸收峰也减弱，这一结果说明SA-DAAM分子上的-COO-与CS分子上的-NH3+发生了离子间的静电结合。
　　2.5 GP-CS、GP-CS-SA和GP-CS-SA-DAAM复合凝胶的形貌表征分析
　　图3（a）为GP-CS的微观形貌结构，图3（b）、（c）、（d）、（e）是GP-CS-SA复合凝胶质量比为8：2，7：3，6：4，5：5的微观形貌结构，图3（f）、（g）、（h）、（i）是GP-CS-SA-DAAM复合凝胶质量比为8：2，7：3，6：4，5：5的微观形貌结构。从图3（a）、（b）、（c）、（d）、（e）可以看出GP-CS与不同浓度梯度比的GP-CS-SA凝胶，其孔径不仅疏松宽大且孔壁的结构较薄;而图3（f）、（g）为GP-CS-SA-DAAM质量比为8：2、7：3，可观察到其凝胶孔径較小且孔隙结构发达，而图4（h）、（i）图片均可观察到凝胶明显紧密排列的筛孔，且孔隙结构发达，分布相对均匀，孔壁较厚。结果表明，随着SA-DAAM浓度的增大，其孔隙结构越发达，孔壁的机械强度逐渐增强且凝胶的筛孔排列紧密，特别是GP-CS-SA、GP-CS-SA-DAAM质量比同为5：5时，GP-CS-SA-DAAM凝胶的孔隙结构较GP-CS-SA凝胶的孔隙结构发达，都极大说明了SA-DAAM对GP-CS凝胶结构有着较为明显的调控作用。 　　2.6 原料及复合凝胶的热重分析
　　如图4（a）所示，CS受热时，其DTA曲线在60℃左右出现一个明显的吸热峰。在50～100℃温度范围内TG曲线失重率仅为-8.02%，说明CS在此范围内，只失去水，没有发生降解反应。TG曲线在230℃～550℃出现两个明显的失重峰，总的失重量占总重量的82%左右，故图中4（a）DTA曲线中297℃左右的放热峰为CS的热降解峰。
　　GP有五个结晶水，如图4（b）所示，GP受热时，其DTA曲线在77℃，265℃左右出现两个明显的吸热峰，在345℃左右出现一个放热峰。在55℃～84℃温度范围内TG曲线失重率仅为-6.27%，GP在此范围内，只脱去结晶水，无降解反应发生，在238℃～274℃温度范围内TG曲线失重率为-16.28%，GP进一步脱去结晶水。TG曲线在310℃～380℃出现两个明显的失重峰，失重率为-7.87%，而GP的熔点>300℃，故图中4（a）的DTA曲线中347℃左右的放热峰为GP的熔点峰。
　　如图4（c）所示，SA受热时，DTA曲线在76℃左右出现一个明显的吸热峰，在238℃、394℃、551℃左右分别出现了放热峰。席国喜[10]等研究表明海藻酸钠分子60℃～170℃脱去结合水，220℃～280℃之间SA分子裂解为中间产物，300℃～370℃为中间产物进一步裂解并部分碳化，560℃左右氧化成Na2O。图4（c）中在42℃～124℃温度范围内SA的TG曲线失重率为-10.91%，在此范围内，仅为SA分子内水分的失去，在212℃～255℃温度范围内TG曲线失重率为-31.73%，说明SA分子链断裂，进行了裂解反应。TG曲线在351℃～577℃出现两个明显的失重峰，失重率为-10.42%，故而394℃、551℃左右分别出现的放热峰表明了SA分子中间产物进一步裂解和氧化形成Na2O。
　　如图4（d）所示，SA-DAAM受热时，DTA曲线在80 ℃，269 ℃左右分别出现吸热峰，252 ℃左右出现放热峰。TG曲线在35～126 ℃内SA-DAAM失重率为-12.19%，此为SA-DAAM分子内部结合水的失去，在220～288 ℃内，SA-DAAM失重率为-42.58%，说明SA-DAAM发生了降解反应。
　　图4（e）、（f）、（g）、（h）、（i）、（j）、（k）、（l）、（m）分别是GP-CS、GP-CS与SA质量比分别为8：2、7：3、6：4、5：5，GP-CS与SA-DAAM质量比分别为8：2、7：3、6：4、5：5的复合水凝胶热重图。图中的复合凝胶DTA曲线在26～113 ℃之间都出现了一个明显的吸热峰，且复合水凝胶的TG曲线中在26～113 ℃内的失重率在-22%左右，说明复合凝胶在此温度范围内，失去凝胶分子内的水。图中的复合凝胶DTA曲线在150-300 ℃之间都出现了一个明显的吸热峰，凝胶中聚合物发生分解。GP-CS、GP-CS-SA、GP-CS-SA-DAAM复合水凝胶的TG-DTA曲线有不同程度的变化，但总体趋势相差无几，因此可以认为，GP-CS、GP-CS-SA、GP-CS-SA-DAAM复合水凝胶的热稳定性没有很显著差异。
　　2.7 GP-CS-SA、GP-CS-SA-DAAM复合凝胶的溶胀特性
　　图5是GP-CS-SA在37℃模拟泪液中的溶胀性能研究。随着SA浓度的增加，GP-CS-SA复合水凝胶的溶胀率也随着增加。当W（GP-CS）：W（SA）为8：2时，凝胶在37℃模拟泪液中的平衡溶胀率为12%，质量比为7：3时，平衡溶胀率为22%，质量比为6：4时，平衡溶胀率为30%，质量比为5：5时，平衡溶胀率高达45%。可看出SA浓度对凝胶溶胀性能具有较为明显的影响。
　　图6是GP-CS-SA-DAAM在37 ℃模拟泪液中的溶胀性能研究，图中同样表明了SA-DAAM浓度对凝胶溶胀性能的影响，其浓度越高，凝胶的平衡溶胀率越增高。当W（GP-CS）：W（SA-DAAM）为8：2时，平衡溶胀率为13%，质量比为7：3时，平衡溶胀率为14%，质量比为6：4时，平衡溶胀率为16%，而质量比为5：5时平衡溶胀率则达到19%。GP-CS-SA-DAAM四个不同浓度梯度的复合凝胶溶胀率小幅度增加，这是由于双病酮丙烯酰胺的-C=C-与SA侧链上的羟基进行反应，使SA-DAAM共聚物呈现疏水性，故GP-CS-SA-DAAM在模拟泪液中的平衡溶胀率较GP-CS-SA的平衡溶胀率低。
　　故当W（GP-CS）：W（SA）与W（GP-CS）：W（SA-DAAM）同为5：5时，GP-CS-SA平衡溶胀率高达到45%，GP-CS-SA-DAAM平衡溶胀率仅为19%。因为人的泪小管直径很小，仅为0.5～0.8 mm，虽然有弹性但极其有限，故注射用的复合溶胶溶胀性能需要控制在适宜的范围内。
　　2.8 GP-CS-SA、GP-CS-SA-DAAM复合凝胶的降解特性
　　图7和图8是SA、SA-DAAM浓度分别对GP-CS-SA与GP-CS-SA-DAAM凝胶的降解性能研究。由图中可看出当SA、SA-DAAM浓度增大时，GP-CS-SA、GP-CS-SA-DAAM在1～2天内会发生溶胀作用，随后才会发生降解。在第3～7天，W（GP-CS）：W（SA）、W（GP-CS）：W（SA-DAAM）同为为8：2、7：3、6：4、5：5时，GP-CS-SA-DAAM的残留率比GP-CS-SA的残留率要高。W（GP-CS）：W（SA）、W（GP-CS）：W（SA-DAAM）同为5：5时，GP-CS-SA残留率保持在9.08%，GP-CS-SA-DAAM的残留率保持在10.02%。说明GP-CS-SA-DAAM复合凝胶较GP-CS-SA复合凝胶，更适合调控可注射水凝胶在泪道治疗中的时间。
　　3  结语
　　本文采用自由接枝共聚法，以过硫酸钾为引发剂，双丙酮丙烯酰胺（DAAM）改性的海藻酸钠（SA），制得的海藻酸钠-双丙酮丙烯酰胺（SA-DAAM）共聚物。通过物理交联法，将SA、SA-DAAM分别与GP-CS复合制得GP-CS-SA、GP-CS-SA-DAAM复合水凝胶。将GP-CS-SA与GP-CS-SA-DAAM复合水凝胶性能相比，GP-CS-SA-DAAM体系相转变时间较短，溶胀性能较好，微观结构孔隙更发达，机械强度较强，且降解性能稳定。可见当壳聚糖质量浓度为2.2%（w/v），β-甘油磷酸钠质量浓度为56%（w/v），改性海藻酸钠质量浓度为2%（w/v）时，GP-CS与SA-DAAM质量比为5：5时，GP-CS-SA-DAAM复合凝胶作为制备泪道栓塞可注射型凝胶是具有一定的优越性的。
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