绞股蓝提取物制备工艺研究

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　　【摘 要】 目的：研究出绞股蓝提取物，为绞股蓝产品研发提供实验数据。方法：建立绞股蓝提取物的化学评价方法;优化绞股蓝提取物的提取工艺，用化学评价方法分别对绞股蓝的乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数4个单因素进行考察，以L9（34）正交表设计优化工艺，筛选出最佳提取工艺。结果：经单因素考察和正交优化得到绞股蓝提取物制备工艺为料液比为1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，加热回流提取3次，每次45min，绞股蓝总皂苷含量为0.1025mg/mL，提取率为10.25%。结论：建立的化学评价方法可评价绞股蓝提取物;制备工艺能为绞股蓝产品研发提供依据。
　　【关键词】 绞股蓝;提取物;制备;工艺优化
　　【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）3-0047-05
　　Abstract：Objective Study the preparation process conditions of Gynostemma pentaphyllum total saponins to obtain the optimal preparation scheme， which provides the research and development of Gynostemma pentaphyllum products.Method Firstly， to establish a chemical evaluation method for the extract of Gynostemma pentaphyllum.Secondly，to study the extraction technology of Gynostemma pentaphyllum extract was optimized by chemical evaluation method， four single factors of ethanol concentration， material liquid ratio， extraction time and extraction times of Gynostemma pentaphyllum were investigated， and the optimum extraction technology was selected by L9（34）Orthogonal table design optimization process.Results By single factor investigation and orthogonal optimization， the preparation process of Gynostemma pentaphyllum extract was obtained by 70% ethanol with a material liquid ratio of 1∶[KG-*3/5]8， three times by heating reflux， and the content of total saponins of Gynostemma pentaphyllum was 0.1025mg/ml， and the extraction rate was 10.25%.Conclusion Firstly， the established chemical evaluation method can evaluate the blue extract of Gynostemma pentaphyllum. Secondly， the developed preparation technology can provide the basis for the research and development of Gynostemma pentaphyllum products.
　　Keywords：Gynostemma Pentaphyllum;Extracting Products;Preparation;Process Optimization
　　絞股蓝为葫芦科绞股蓝属藤本植物，号称“南方人参”[1-2]，是2002年卫生部公布的可用于保健食品的中药[3]。绞股蓝主要有效成分是绞股蓝皂苷、绞股蓝糖苷、水溶性氨基酸、黄酮类[4]、多种维生素[5]、微量元素、矿物质等，有益气健脾、化痰止咳、清热解毒之功效[6]。临床上发现，绞股蓝具有降血脂、调血压、防治血栓、调节血糖、促睡眠、缓衰老、防抗癌[7]、提高免疫力、调节人体生理机能等多种作用[8]。目前对绞股蓝皂苷提取方法[9]主要有甲醇、正丁醇提取法、生物提取法、超声提取法、硅胶吸附法、大孔树脂吸附法[10]等。这些提取方法[11-16]易造成有机试剂残留，致使人们服用时存在较大安全隐患。如用甲醇提取时溶剂处理不当易引起失明、肝病[17]。正丁醇虽然有非常出色的萃取效果，但同样有着不容忽视的危害，使用不当易引起肝皮肤功能异常、嗅觉减退等毒性反应[18-19]。不同厂家提取的绞股蓝皂苷质量存在较大差异。目前，对绞股蓝皂苷系统的制备工艺的研究甚少，有关文献仅是简单的提取方法的介绍。
　　基于以上研究背景，本课题采用单因素考察和正交设计试验相结合的方式系统研究绞股蓝皂苷提取物的制备工艺，并进行三批样品的验证性实验，结果表明该工艺稳定可靠，重现性高，提供的工艺技术能为后期绞股蓝产品转化提供参考。
　　1 仪器与材料
　　1.1 药材来源 绞股蓝（批号：18050801）药材来源于广东大森林连锁药店有限公司，经嘉应学院医学院天然药物教研室聂华博士鉴定为葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝 Gynostemma pentaphyllum（Thunb.） Makino干燥全草。 　　1.2 仪器 HH恒温水浴锅（金坛市中大仪器厂）;DW调温电热器（上海平环燃烧设备工程技术有限公司）;YF3-1型流水式粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）;JP-100S型超声波清洗器（深圳市洁盟清洗设备有限公司）;FA2004型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）;N-1100V型旋轉蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）;DHG-9246电热鼓风干燥箱（常州普天仪器制造有限公司）;UV-1800型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）。
　　1.3 材料 无水乙醇（分析纯，广州化学试剂厂），硫酸（化学纯，广州化学试剂二厂），香草醛（化学纯，汕头市光华化学厂），人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-200420，中国药品生物制品检定所）。
　　2 方法与结果
　　2.1 建立绞股蓝总皂苷化学评价方法
　　2.1.1 溶液制备
　　2.1.1.1 供试品制备 将绞股蓝干燥全草粉碎，过50目筛，称取50g，加60%乙醇500mL，回流提取60min，倾出提取液;药渣加60%乙醇400mL，回流提取45min，倾出提取液，反复提取六次，合并提取液，滤过两次，滤液减压浓缩，得总浸膏。取0.1g总浸膏，用乙醇溶解定容至500mL容量瓶，取1mL溶液至10mL容量瓶，置80℃水浴中挥干溶剂备用。
　　2.1.1.2 对照品制备 精密称取人参皂苷Rb1 4mg，用乙醇制成每1mL含有2mg的溶液，备用。
　　2.1.2 检测波长的选择 取对照品溶液与供试品溶液，分别加入8%香草醛乙醇溶液（现配现用）0.5mL，77%硫酸溶液5mL，摇匀，密塞，置60℃水浴加热显色15 min，取出，立即用冰水冷却10min，在200～700nm波长处扫描，结果显示对照品溶液和供试品溶液在538nm处有最大吸收，无干扰，故选择测定波长为538nm。
　　2.1.3 方法学考察
　　2.1.3.1 标准曲线绘制 分别精密吸取对照品溶液60μL、80μL、100μL、120μL、140μL、160μL于10mL容量瓶，置80℃水浴中挥干溶剂。分别加入8%香草醛乙醇溶液（800mg香草醛溶于10mL无水乙醇溶解中，现配现用）0.5mL，77%硫酸溶液5mL，摇匀，密塞，置60℃水浴加热显色15min，取出，立即用冰水冷却10min，以随行试剂为空白，按照《中华人民共和国药典》2015年版一部紫外-可见分光光度法（附录VA），于538nm波长处测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标，浓度（mg·mL-1）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程为y=2.9571x+0.0394， 相关系数为0.9952，人参皂苷Rb1含量在0.12～0.32mg/mL范围内有良好的线性关系。结果如图1所示。
　　2.1.3.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液60μL，置10mL容量瓶，按2.1.3.1项下方法测定，重复6次，RSD值为1.14%，表明仪器精密度良好。
　　2.1.3.3 重复性试验 取供试品溶液5份，照紫外分光光度法测定，重复5次，RSD值为1.36%，表明该方法重现性良好。
　　2.1.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在0h、2h、4h、6h、8h、24h时测定，RSD值为1.87%，表明该样品液在24h内稳定。
　　2.1.3.5 准确度试验 精密吸取1mL已知浓度的样品溶液置10mL容量瓶，精密加入样品量的80%、100%、120%的对照品，分别加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL，77%硫酸溶液5mL，摇匀，密塞，置60℃水浴加热显色15min，取出，立即用冰水冷却10min，按2.1.3.1项下测定，试验回收率为99.3%，RSD为1.01%，表明此方法加样回收率良好。
　　2.1.3.6 样品的测定 精密量取2.1.1.1项下供试品，加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL，77%硫酸溶液5mL，摇匀，密塞，置60℃水浴加热显色15min，取出，立即用冰水冷却10min，照紫外分光光度法测定。
　　2.2 绞股蓝总皂苷制备工艺研究
　　2.2.1 单因素考察 以乙醇作为提取溶媒，提取工艺选择乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次数进行单因素考察。
　　2.2.1.1 乙醇浓度考察 取15g绞股蓝粉末样品，置圆底烧瓶中，分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇150mL，回流提取15min，过滤，收集提取液，置蒸发皿中蒸干得浸膏，平行操作，通过绞股蓝皂苷含量测定结果分析不同乙醇浓度对绞股蓝皂苷提取物提取工艺的影响，结果见表1。
　　由表1、图2可知，以70%乙醇提取的绞股蓝皂苷含量最高，提取率达9.023%，与80%乙醇和90%乙醇提取率和70%乙醇的提取率接近，但却降低了乙醇浓度，节约了成本，故选择70%乙醇作为绞股蓝皂苷的溶媒浓度。
　　2.2.1.2 料液比考察 取15g绞股蓝粉末样品，置圆底烧瓶中，分别以料液比1∶[KG-*3/5]4、1∶[KG-*3/5]6、1∶[KG-*3/5]8、1∶[KG-3/5]10、1∶[KG-*3/5]12、1∶[KG-*3/5]14加入70%乙醇，回流提取15min，过滤，收集提取液，置蒸发皿中蒸干得浸膏，平行操作，通过绞股蓝皂苷含量测定结果分析不同料液比对绞股蓝皂苷提取物提取工艺的影响，结果见表2。
　　由表2、图2可知，以料液比1：8提取的绞股蓝皂苷含量最高，提取率达8.493%，故选择料液比为1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇作为绞股蓝皂苷的溶剂用量。
　　2.2.1.3 提取时间考察 取15g绞股蓝粉末样品，置圆底烧瓶中，以料液比1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，分别回流提取15min、30min、45min、60min、90 min、120min，过滤，收集提取液，置蒸发皿中蒸干得浸膏，平行操作，通过绞股蓝皂苷含量测定结果分析不同提取时间对绞股蓝皂苷提取物提取工艺的影响，结果见表3。 　　 由表3、图2可知，提取时间为45min时提取率最高，可达8.442%，超过45min后，皂苷提取率随提取时间的增加而下降，故选择提取时间为45min。
　　2.2.1.4 提取次数考察 取15g绞股蓝粉末样品，置圆底烧瓶中，以料液比1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，回流提取45min，分别提取1次、2次、3次，過滤，收集提取液，置蒸发皿中蒸干得浸膏，平行操作，通过绞股蓝皂苷含量测定结果分析不同提取次数对绞股蓝皂苷提取物提取工艺的影响，结果见表4。
　　由表4、图2可知，不同提取次数下提取绞股蓝，以料液比为1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇回流提取4次，每次45min，绞股蓝皂苷提取率最高，可达8.892%，与料液比为1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇回流提取3次，每次45min的绞股蓝皂苷提取率相当接近，但却减少了提取次数，节约了成本，故选择提取次数为3次。
　　2.2.2 正交设计试验 用正交设计试验优化绞股蓝皂苷的提取工艺，根据相关资料与预实验结果，选取影响绞股蓝皂苷的3个因素，即乙醇浓度、提取时间、提取次数。每个因素下各选取3个水平，采用L9（34）正交表设计实验，结果见表5。
　　由表6、表7分析结果可知，提取次数对绞股蓝总皂苷的提取率影响较显著，影响大小为C>B>A，即提取次数>提取时间>乙醇浓度。绞股蓝总皂苷最佳制备工艺条件为A2B2C3，即料液比为1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，加热回流提取3次，每次45min。
　　2.2.3 验证性实验 按2.2.2项下最佳提取工艺，制备三批绞股蓝皂苷提取物，照紫外分光光度法测定。由表8可知，采用最佳提取工艺，即料液比为1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，加热回流提取3次，每次45min，得到的提取物中绞股蓝皂苷提取率为10.25%，表明该工艺重现性好。
　　3 讨论
　　该实验系统研究绞股蓝皂苷的提取工艺，建立了绞股蓝提取物的化学评价方法，分别对绞股蓝的乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数4个单因素进行考察，以L9（34）正交表设计优化工艺，筛选出最佳提取工艺为料液比为1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，加热回流提取3次，每次45min;连续进行三批样品制备，证明该工艺的重现性好;制备了绞股蓝皂苷提取物，为绞股蓝产品化发展提供数据支撑。
　　通过对绞股蓝指标成分含量研究，实验得出了绞股蓝皂苷提取物，但是研究中仍存在不足。绞股蓝总皂苷约有140余种[20]，其成分的含量测定和成品标准，都以人参皂苷Rb1的多少作为标准。故本文以人参皂苷Rb1为检测目标建立了绞股蓝皂苷的化学评价方法和提取工艺，但现有技术不能指证绞股蓝发挥神奇疗效仅因为含有人参皂苷Rb1成分。在今后的进一步研究中，还需综合考虑绞股蓝皂苷中的其他成分对人参皂苷Rb1的相互影响，以期找到更完善的绞股蓝皂苷制备工艺。
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