大量提取羊草基因组方法的优化

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　　摘要 羊草是我国北方草原上广泛分布的一种禾本科牧草，其对畜牧业及生态环境有着至关重要的作用，其中，获得大量完整的羊草基因组是进行羊草分子生物学研究的基础。首先对常用的提取植物基因组DNA方法及其原理进行归纳分析，然后利用常用的吸附柱法、改良SDS法和改良CTAB法，分别对羊草基因组进行大量提取。结果发现，改良的CTAB法在大量提取时需要用50 mL离心管，离心转速选取5 000 r/min时基因组断裂较少，同时最终用毛细管将基因组DNA挑出来，既提高了DNA的产率又保证了DNA的完整性，同时提高了纯度。
　　关键词 羊草，基因组DNA，CTAB法，SDS法
　　中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）06-0080-03
　　Abstract Leymus chinensis is a grass species that is widely distributed on grasslands in northern China. It plays a vital role in animal husbandry and the ecological environment.Obtaining a large number of complete genomes is the basis for molecular biology research of L.chinensis.Firstly，the commonly used methods for extracting plant genomic DNA were summarized and analyzed. Then， the common adsorption column method，improved SDS method and CTAB method in this laboratory were used to extract a large number of L. chinensis genomes.The results showed that the improved CTAB method required a 50 mL centrifuge tube for largescale extraction. The genomic DNA was less broken when the centrifugation speed was selected at 5 000 r/min. At the same time，the genomic DNA was finally picked out with a capillary， which not only improved the DNA yield，but also ensured the integrity of the DNA， and improved the purity.
　　Key words Leymus chinensis，Genomic DNA，CTAB method，SDS method
　　羊草[Leymus chinensis （Trin.）Tzvel.]是我国北方草原上广泛分布的一种禾本科牧草，其耐干旱﹑耐盐碱且适口性较好，在畜牧业及生态环境方面都有着重要的经济价值。科学家们已经对羊草开展了基因组测序﹑亲缘关系分析和抗旱耐盐碱分子机理的研究。其中，基因组DNA的纯度﹑完整性与产量都直接关系着下游试验结果，获得大量高质量的羊草基因组DNA是进行上述分子生物学研究的重要基础。
　　植物材料具有坚韧的细胞壁，且有些植物材料富含多糖类和多酚类等次级衍生物，这些都会影响基因组DNA的质量与产量[1]。对于不同植物以及同种植物的不同组织，提取基因组DNA的最适方法也不同[2]。目前，常用的大量提取植物基因组的方法有SDS（十二烷基硫酸钠）法[3-10]﹑CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法[11-13]﹑吸附柱法[14]﹑尿素法[15]以及高盐低pH法[16-18]。
　　笔者选取去除蛋白和多糖多酚效果较好的3种方法对提取羊草基因组DNA进行比较，包括吸附柱法﹑改良SDS法和改良CTAB法，目的是摸索出一种成本低﹑操作简单﹑DNA产量高以及纯度与完整性都较好的提取羊草基因组的方法，以满足对羊草进行全基因组测序﹑开发分子标记和亲缘关系鉴定等下游试验的需求。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料 羊草。
　　1.2 方法
　　1.2.1 吸附柱法。
　　取0.1 g羊草，提取步骤参照植物基因组提取试剂盒（高效植物基因组DNA 提取试剂盒，DP350，天根生化科技有限公司）说明书。因为商品化试剂盒提取的基因组DNA纯度较好，因此以吸附柱式的商品化试剂盒提取的羊草基因组DNA为对照，分析其他方法的提取效果。
　　1.2.2 改良SDS法。
　　分别取2 g羊草置于液氮中研磨，将羊草叶粉末分别转移到3个60 ℃预热的15 mL提取液（50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L EDTA，临用前加2%β-巯基乙醇）中，此处用50 mL离心管，65 ℃水浴锅中温浴60 min，温浴完毕后在离心管中加7.5 mL苯酚颠倒混匀，再加7.5 mL氯仿颠倒混匀，4 ℃10 000 r/min（对3批样品此处分别用3个转速10 000、8 000和5 000 r/min）离心30 min，吸取上清至新的离心管中。在上清液中加10 μL RNase A（10 mg/mL），常温放置10 min，用等体积氯仿再抽提1次，吸取上清，加2倍冰預冷的无水乙醇，缓慢颠倒离心管，室温静置10 min，用毛细管将基因组DNA挑出来，用70%的乙醇洗涤2～3次，干燥，用500 μL ddH2O溶解DNA。 　　1.2.3 改良CTAB法。
　　步驟同改良SDS法，只是提取液不同，CTAB提取液为100 mmol/L pH8.0 Tris-HCl，1.4 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，2%CTAB，1%PVP（MW40 000，W/V，聚乙烯聚吡咯烷酮），临用前加2%β-巯基乙醇。
　　1.2.4 电泳。分别取1 μL基因组DNA样品上样，加入6×上样缓冲液，经0.8%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，电泳15 min，溴化乙锭染色，以 D2000 DNA Marker（MD114）（TIANGEN）为参照，于紫外凝胶成像系统（BioRad，Gel Doc XR+）下观察并照相。
　　1.2.5 紫外分光光度计检测。取1 μL DNA 样品，用Nanodrop 分光光度计（ND-1000，Thermo Fisher Scientific，USA）检测DNA的浓度和纯度（OD260/OD280 ）。
　　2 结果与分析
　　2.1 利用天根植物基因组提取试剂盒提取羊草基因组DNA
　　由图1可知，试剂盒提取的3个羊草基因组DNA平行样的提取结果相对一致，电泳条带比较平整，没有拖尾，说明DNA完整性较好，蛋白质和RNA残留较少，但DNA的量较少。
　　2.2 利用改良SDS法提取羊草基因组DNA
　　从图2可以看出，改良SDS法提取的3个羊草基因组DNA样品分别是离心转速为10 000、8 000和5 000 r/min的提取结果，10 000、8 000 r/min提取DNA的电泳条带拖尾严重，说明DNA断裂严重，5 000 r/min提取DNA的电泳条带有一些拖尾，这是DNA浓度较高导致的。完整性稍好，3个样品的电泳孔中较亮，说明蛋白质残留较多，RNA残留较少，说明该方法去除蛋白质杂质等效果不好，但相对于试剂盒提取效果，改良SDS法提取的DNA量较多。
　　2.3 利用改良CTAB法提取羊草基因组DNA
　　从图3可以看出，改良CTAB法提取的3个羊草基因组DNA样品分别是离心转速为10 000、8 000和5 000 r/min的提取结果，其中5 000 r/min的DNA样品出现弯曲的现象，这是由于DNA浓度较高导致的，其完整性较好，10 000、8 000 r/min的DNA完整性较差，基因组断裂，说明在大量提取基因组DNA时较高转速会导致基因组断裂，应采取低转速，同时，3个样品的点样孔较干净，没有蛋白残留，而且无RNA残留，说明该方法去除蛋白质杂质等效果好。与试剂盒和改良SDS法提取效果相比，改良CTAB法提取的DNA的量非常多。
　　2.4 DNA浓度及纯度测定——紫外分光光度法
　　根据紫外分光光度法结果（表1）分析利用这3种提取羊草基因组DNA的方法，3个重复样本提取效果较为均一，吸附柱法提取DNA的OD260/OD280为1.80～1.93，纯度较好但浓度较低，浓度平均值为163 ng/mL，改良SDS法提取DNA的OD260/OD280为1.53～1.79，纯度较差，说明蛋白残留较多，但浓度较高，浓度平均值为1 750 ng/mL，经过改良CTAB 法提取的羊草基因组 DNA 纯度和浓度均较好，OD260/OD280为1.89～1.94，尤其是浓度非常高，浓度平均值达3 363 ng/mL。
　　3 结论与讨论
　　此次试验所用的3种方法中，吸附法操作简单，同时吸附柱吸附DNA后不易降解，蛋白质杂质去除效果好，但由于每次上样量不能超过0.1 g，因此提取量相对较少。与试剂盒相比，利用改良的SDS法和CTAB法对2 g羊草进行大量提取时虽然步骤多，但优点在于完整性较好。提取量明显提高。同时，离心10 000、8 000 r/min时DNA断裂严重，离心5 000 r/min时基因组断裂较少，所以在提取羊草基因组时转速不能过高，避免基因组断裂，改良SDS法中提取液需要现用现配，而且大量提取时蛋白残留较严重。改良的CTAB法提取液中加入了PVP和β-巯基乙醇，抑制了褐化，而且在大量提取时需要用50 mL离心管，离心转速选取5 000 r/min时基因组断裂较少，同时最终用毛细管将基因组DNA挑出来，既提高了DNA的产率又保证了DNA的完整性，同时提高了纯度，所以利用该方法提取的DNA纯度﹑产率和完整性都较好。综合考虑，大量提取羊草基因组时利用该试验中的改良CTAB法最有效。
　　在此对提取植物DNA提供几点建议：①材料研磨后要尽快放到提取液中，否则DNA易降解，②加入提取液后60 ℃温浴时间不要超过60 min，否则容易褐化，③整个操作过程动作要轻柔，否则基因组易断裂，④在使用酚去除蛋白时，应使用TRIS饱和酚，因为使用水饱和酚时DNA可溶于有机相，不易分离出DNA，⑤离心后取各上层液体时，不应吸取过多，以减少杂质，⑥低温的无水乙醇在沉淀DNA时效果更好，⑦因为乙醇可抑制酶活性，所以DNA干燥时必须将乙醇晾干，否则会影响后续试验结果，⑧苯酚有强腐蚀性，乙醇和氯仿易着火、易爆炸、易挥发，能刺激神经系统，试验过程中
　　应穿实验服。
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