重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌

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　　摘要：为建立创伤弧菌的重组酶聚合酶扩增技术（RPA）检测方法，根据编码创伤弧菌DNA促旋酶的B亚单位蛋白（Gyrase Beta Subunit，gryB）的基因保守序列，设计RPA特异性引物，建立创伤弧菌gryB基因的RPA检测方法并测试其特异性、灵敏度和应用效果。结果发现，建立的RPA检测方法特异性好，能够从创伤弧菌中检测到234 bp的特异性条带，仅需在37 ℃下恒温反应40 min，不需要特殊的仪器设备;该方法的灵敏度与PCR相当，可达到0.1 ng/μL，应用检测结果也表明该方法与传统培养方法相当。因此，本研究建立的RPA方法检测gryB特异性强、灵敏度高，无需特殊的仪器设备，适合实验室快速检测。
　　关键词：创伤弧菌;gryB基因;RPA;检测
　　中图分类号：S182 文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）04-0073-04
　　收稿日期：2018-12-06
　　基金项目：广东省基金团队项目（编号：S2012030006235）;广东省科技计划（编号：2016A050503031）;广东出入境检验检验局科技计划（编号：2017GDK48）;广东省汕头市科技计划（编号：汕府科[2017]166号-38）。
　　作者简介：凌 莉（1978—），女，广东人，硕士，高级工程师，主要从事食品安全研究。E-mail：joiceling@163.com。
　　通信作者：李志勇，博士，研究员，主要从事食品安全研究。E-mail：lizy@iqtc.cn。
　　创伤弧菌是一种带有荚膜的革兰氏阴性嗜盐弧菌，在海水养殖的牡蛎、虾和蟹等贝类、甲壳类水生动物中分布广泛，是流行程度、危害程度最高的食源性致病菌之一[1-2]。人食用生的或未经充分加工的海产品，以及通过皮肤创口接触海水入血均可感染，并在短時间内出现败血症“蜂窝组织炎”出血性大疤，半数以上患者可因多脏器功能衰竭而死亡，因此创伤弧菌又被称为“海洋中的无声杀手”[3]。当下世界上大部分沿海国家均有创伤弧菌的致病报道，我国江浙、闽粤沿海及台湾地区亦有较多的感染报道，更有数例因创伤弧菌感染引起的败血症患者，在3～4 d内均出现腹腔内广泛性坏死、多器官功能衰竭而死亡的案例，是公众饮食健康的重大威胁之一，所以对创伤弧菌的检测在公共卫生上具有十分重要的意义[4]。
　　目前，对创伤弧菌的检测仍主要依靠传统方法，即首先利用选择性培养基增菌，进而结合生化及血清学方法进行鉴定。传统方法检测结果准确，但是存在检测效率低、检测目标单一、灵敏度低且耗时长、操作繁琐等不足。为满足致病菌快速检测的要求，技术人员发展了酶联荧光免疫检测法（VIDAS-CHL）、酶免疫法（EIA）、聚合酶链式反应（PCR）、胶体金试纸条法、API生化鉴定试纸条法、环介导恒温扩增（LAMP）技术和实时荧光PCR等方法。其中，实时荧光PCR及PCR相关的其他改良技术以操作简便快捷、灵敏度高等显著优势，近年来在致病菌检测中的应用越来越广泛[5]，但荧光检测设备普遍售价偏高、产物片段偏小、引物探针设计要求较高等不可回避的缺陷，在一定程度上限制了其推广应用，尤其是不利于非实验室环境下现场检测以及基层实验室的推广应用。
　　RPA（recombinase polymerase amplifcation）是继LAMP之后的另一种等温核酸扩增技术[6]，该技术扩增利用单链DNA结合蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）将双链模板DNA解链，在DNA聚合酶的作用下，引物与特定模板正确配对形成复合体，然后由DNA聚合酶延伸引物生成新的DNA互补链。该方法主要具备以下优点：（1）恒温37 ℃下即可反应，不需要高低温度循环实现核酸解链和退火;（2）只需要1对引物，反应时间短，仅需40 min;（3）结果易辨识，RPA扩增产物具有特定大小的条带[7]，而且还可进行进一步的测序确认。
　　目前，国内尚未见到利用RPA技术检测创伤弧菌的报道，本研究拟根据编码创伤弧菌DNA促旋酶的B亚单位蛋白（Gyrase Beta Subunit）的gryB基因，设计RPA检测引物，构建创伤弧菌的RPA检测方法，并验证其特异性和灵敏度，建立一种快速检测创伤弧菌gryB的简便高效、特异性强、灵敏度高、适于现场应用检测的技术方法。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　创伤弧菌（ATCC27562）、拟态弧菌（ATCC33653）、副溶血弧菌（ATCC17802）、河流弧菌（ATCC33809）、溶藻弧菌（ATCC17749）、霍乱弧菌（ATCC39315）、哈维氏弧菌（ATCC33842）、沙门氏菌（ATCC14028）、大肠埃希菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和单增李斯特菌（ATCC19114）均为本机构购买的标准菌株，其购买来源为中国科学院水生生物研究所、广东食品微生物安全工程技术研究开发中心和美国MBL公司。应用检测的样品均为本机构2016年法定和委托检验中的留样，所用细菌基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司产（货号DP302），引物由上海生物工程技术有限公司安排合成，电泳级琼脂糖、DNA Marker及显色剂购自宝生物大连生物技术有限公司，RPA扩增试剂盒为TwistDX公司产TwistAmp Basic kits。
　　1.2 主要仪器与设备
　　PCR扩增仪（Veriti，ABI公司）、核酸蛋白分析仪（ND-1000，Thermo公司）、电泳仪（DYY-6C，北京六一）、凝胶成像系统（Tanon-1 600，天能公司）。
　　1.3 方法
　　1.3.1 基因组DNA提取 　　先将上述标准菌株按照国家标准GB4789进行复壮增菌及生化鉴定，再参照试剂盒说明书，提取上述增菌液的基因组DNA，使用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度及纯度并统一稀释为100 ng/μL备用。
　　1.3.2 引物设计
　　参考RPA引物设计的要求，根据gryB基因的保守序列，使用Oligo V6.22软件进行引物的设计和筛选，入选序列再利用Primer Blast工具（NCBI官方网站提供）进行特异性确认，最终交由上海生物工程技术有限公司安排合成。最终设计检测创伤弧菌的RPA检测引物，扩增条带234 bp，序列具体如下：上游引物：5′-GCTTGAATACCACCTTCATACATGAAGTGATC-3′;下游引物：5′-TCATGGTGTGCCTGATGCACCGCTTGCTAT-3′。
　　1.3.3 RPA检测方法建立
　　以“1.3.1”节中制备的DNA为模板，采用上述引物进行RPA扩增，同时设置超纯水为阴性对照，测试恒温37 ℃反应时长分别为30、40、50、60 min时的扩增效果。RPA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2 mL Twist Amp反应管（Twist AmpBasic kits，Twist）中加入再水化缓冲液（Rehydration Buffer）29.5 μL，去离子水12.5 μL，上、下游引物各2 μL（终浓度为0.4 μmol/L），模板DNA 1.0 μL，最后再加入醋酸镁溶液2.5 μL（280 mmol/L）。RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50.0 μL苯酚/氯仿溶液，充分混匀后12 000 r/min离心2 min，取上清液5 μL点样于1.5%琼脂糖凝胶，使用1×TBE缓冲液进行电泳，电泳条件为5 V/cm，恒压电泳40～60 min，最终在凝胶成像系统上观察结果。
　　1.3.4 RPA检测方法特异性评价
　　按照“1.3.3”节的RPA检测反應体系及适用扩增时长，对前述11种标准菌株的基因组DNA进行检测，对所建立的RPA检测方法特异性进行评价。
　　1.3.5 RPA检测方法灵敏度评价
　　将创伤弧菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，共5个稀释度，以梯度稀释的DNA为模板，按照“1.3.3”节所示RPA检测反应体系进行RPA灵敏度试验，并与蒋蔚等报道的PCR检测方法的灵敏度[8]进行比较，评价RPA检测方法的灵敏度。
　　1.3.6 RPA检测方法应用效果评价
　　选取本机构2016年检测留样样品50份，包括20份阳性样品，其中创伤弧菌确认阳性检出2份。样品主要为冻虾仁、冻凤尾对虾、冻牡蛎、活青蟹、金鲳鱼以及水质监控样本，参考食品卫生微生物学检验国家标准进行样品处理，使用碱性蛋白胨水增菌培养10 h，取2 mL 增菌液离心富集，使用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，货号DP302）提取DNA，使用建立的RPA方法进行创伤弧菌检验，以结果的一致性来评价方法的应用效果。
　　2 结果与分析
　　2.1 RPA检测方法的构建
　　以创伤弧菌标准菌株基因组DNA为模板，并以超纯水为阴性对照，测试了不同扩增时长的RPA检测效果，由图1可知，在40 min时便可达到较为理想的扩增效果，gryB扩增条带与预期目的条带大小一致，约234 bp，阴性对照没有条带，建立的RPA检测体系能够准确检测到gryB基因。
　　2.2 RPA检测方法的特异性评价
　　由图2可知，gryB的RPA特异性评价结果显示，创伤弧菌能够检测到234 bp的特异性条带，其他10株标准菌株：拟态弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、哈维氏弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌均未检测到条带，说明该方法具有较强的特异性。
　　2.3 RPA检测方法的灵敏度评价
　　灵敏度测试结果（图3）显示，当RPA检测方法反应时间为40 min，DNA含量为0.1 ng时，可检测234 bp大小目的条带，该灵敏度结果与蒋蔚等建立的检测创伤弧菌groEL基因的PCR方法一致;当DNA含量为0.01 ng时，2种方法均未能扩增到目的条带，说明RPA方法与PCR方法的灵敏度相当。
　　2.4 RPA检测方法的应用效果
　　应用建立的RPA检测方法，对本机构2016年检测的20份阳性检出留样（其中创伤弧菌确认阳性检出2份）和30份阴性留样进行了复检，结果共有2份样本检出创伤弧菌，该留样检测结果与之前传统培养及生化鉴定的结果完全一致，表明该方法具有较好的应用效果。
　　3 讨论
　　RPA技术是近些年兴起的常温扩增技术，目前在病毒、病原菌及转基因的检测中均有成功应用的先例[8-14]，但尚未见创伤弧菌的相关研究报道。本研究建立了针对创伤弧菌特异性gryB基因的RPA检测方法，并对该方法进行了应用测试，结果显示该方法特异性强，灵敏度与普通PCR相当，可较好应用于水生动物及其加工产品的检测，且反应耗时短、对设备依赖程度低，适合基层单位和现场检测使用，为创伤弧菌的疫情监控、污染监测等提供了更为简便高效的解决手段。
　　研究表明，gryB基因与DNA复制、限制、修饰和修复相关，在细菌DNA的转录和复制中发挥重要作用，近年来常被选用于细菌系统发育分析及细菌鉴定[15-16]。本研究亦是基于gryB基因保守序列建立了RPA检测方法，在特异性、灵敏度及应用检测方面上也均达到了预期效果。
　　RPA技术最大的优点在于在37 ℃恒温反应，不需要进行复杂的反应参数优化，本研究也只是对比测试不同反应时长的扩增效果，发现在40 min时扩增产物基本可满足检测需求，考虑时效性及污染防控，未选用扩增更长但可能更灵敏的反应参数。此外，RPA技术反应温度接近人体温，可不依赖PCR扩增仪，有学者利用该特性建立了一种仅仅利用人体温度即能完成DNA扩增的RPA检测方法[17]，显著拓展了该技术的应用条件。 　　灵敏度是评价检测方法优劣的一个关键参数，本研究建立的RPA技术用于检测gryB方法，其灵敏度和普通PCR方法相当，也与已报道的LAMP检测方法[18-20]相当。但RPA技术相比普通PCR，反应更为快速（仅需30～40 min），且不依赖PCR仪;同时相比LAMP、RPA技术引物设计难度小，产物片段单一，便于后续进行测序确证，具有更高的实用价值。
　　同PCR方法一样，RPA技术也是扩增检测特定基因序列，该序列与目标菌的性状及行为表现并无必然的对应关系，当目标菌数量较少、活力较弱时，使用传统微生物检验方法不一定能检出为阳性，故在应用检测中可能存在假阴性问题[21]。本研究建立的RPA检测方法，对本机构的50例留样的应用检测并未发现假阴性问题，可能与研究的样本数量偏小有关。
　　当然，RPA技术作为一种后起的检测手段，也有不足之处需要完善。首先，RPA体系对于蛋白活性要求比较高，需要保证体系中的各种酶触反应准确进行，其技术的提升依赖现代酶学的发展应用;其次，RPA扩增体系中存在大量蛋白酶，故直接电泳无法分辨出目的核酸片段，必须经过纯化去除蛋白质[7];再次，RPA的关键技术有知识产权的保护，试剂成本相对较高。但RPA技术作为一种新的核酸扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作快速便捷等优点，被誉为“一种可替代PCR的技术”，在病原体检测及食品安全等众多领域已经有了越来越多的推广应用，技术发展及应用前景均较为广阔。
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