新疆农牧区拟蛹螺属2种蜗牛形态特征和分子数据的比较研究

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　　摘要：拟蛹螺属（Pseudonapaeus）种类多为农牧业的害虫，不仅危害各种蔬菜、花卉，其中某些种类还是家畜、家禽双腔科吸虫的中间宿主。本研究主要探究该属形态相似2种蜗牛的形态解剖学和分子生物学特征，确定它们分类，为该类动物的防治和系统分类学研究提供数据基础。形态结果显示，2种蜗牛的生境，贝壳质地、大小和颜色，齿舌以及颚片的形态结构相似;但贝壳形状、壳口齿数、生殖系统的解剖特征等存在显著差异。其中，一种为钻拟蛹螺Pseudonapaeus miser（Martens，1874），另一种为新种，即吐尔根拟蛹螺Pseudonapaeus tuegenensis sp. nov.。分子结果显示：（1）基于COⅠ基因序列（651 bp）构建的系统发育树中，新种和钻拟蛹螺以高支持率（后验概率96%）形成一个单系（支系A），显示二者有密切的亲缘关系，但是钻拟蛹螺3个个体以高支持率（后验概率100%）聚为一支，与新种产生分异;（2）基于ITS1基因序列（610 bp），新种与钻拟蛹螺之间的遗传距离为13.7%（12.5%～15.1%）（与本属其他种间的遗传距离更大），显著高于种内遗传距离2.5%（1.3%～3.5%）。结合COⅠ基因系统发育树的结果，支持二者为不同种。分子分析的结果支持比较形态学的结果，确定吐尔根拟蛹螺P.tuegenensis sp. nov.不同于钻拟蛹螺P.miser（Martens，1874）为一新种，利用分子系统学方法研究该属的分类问题在国内为首次。
　　关键词：拟蛹螺属;形态解剖;COⅠ基因;ITS1;新种;新疆
　　中图分类号：S433.89 文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）04-0121-06
　　收稿日期：2018-11-17
　　基金项目：国家自然科学基金（编号：31260506）。
　　作者简介：楊吕娟（1992—），女，四川遂宁人，硕士，主要从事贝类学研究。E-mail：YLJ687592@163.com。
　　通信作者：张卫红，硕士，副教授，主要从事贝类学研究。E-mail：zwh6879a@163.com。
　　拟蛹螺属（Pseudonapaeus）由Westerlund于1887年建立，隶属于腹足纲（Gastropoda）柄眼目（Stylommatophora）艾纳螺科（Enidae）。该属的多数种类是农业和畜牧业的害虫，常危害各种蔬菜、花卉的幼芽、嫩叶等，其中某些种类为家畜、家禽及野生动物双腔科吸虫的中间宿主[1-2]。陈德牛等报道双腔吸虫病在新疆牧区广为流行，大大影响家畜的体膘和产毛量，甚至引起牲畜死亡，其中间宿主为某些陆生螺类（包括艾纳螺科的一些种类）[3]。
　　拟蛹螺属地理分布较窄，主要分布于中亚以及印度半岛西北部，现记载有40余种[4]。我国对该属的研究相对不足，到目前为止仅报道一种，即钻拟蛹螺P.miser（Martens，1874）。该种在国外分布于塔吉克斯坦、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、俄罗斯、土耳其等地区，在我国仅在新疆阿勒泰、木垒、库尔勒、乌什、阿克苏及天山一带农田和牧区有分布[5-8]。本研究采用比较形态解剖学和分子分析的方法，对采自新疆伊犁贝壳相似的拟蛹螺属2种蜗牛的贝壳形态，齿舌、颚片的电镜扫描结构，生殖系统的解剖特征，线粒体基因（COⅠ）以及核基因（ITS1）的DNA序列进行详尽的比较研究，确定它们的分类，其中一种为钻拟蛹螺P.miser，另一种为新种吐尔根拟蛹螺P.tuegenensis sp. nov.。本研究首次应用比较形态解剖学和分子序列分析的方法探讨该属的分类问题，研究结果可以促进我国陆生贝类系统分类学的研究，也可为该类动物的防治提供数据基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 样本
　　钻拟蛹螺P.miser（Martens，1874）6只标本（XJU E.13031）于2013年8月12日，采自新疆伊宁县多浪农场3队（81°38′E，43°46′N，海拔721 m），采集人为张卫红;53只标本（XJU E.13003）于2015年4月17日，采自新疆新源县铁木里克村（83°08′E，43°33′N，海拔887 m），采集人为杨松（新种采集信息见新种描述）。标本处理参考陈德牛等的方法[9]，保存于无水乙醇中。Orculidae科与艾纳螺科（Enidae）亲缘关系较近[10]，故在NCBI数据库中选取Orculidae科2个种：Schileykula trapezensis（Stojaspal，1981）、Sphyradium doliolum（Bruguiere，1792）的COⅠ基因序列作为外群用于系统发育关系分析，并选取数据库中拟蛹螺属所有种类的ITS1基因共4条序列以及艾纳螺科相关种类COⅠ基因共7条序列用于参考分析（NCBI数据库中仅有拟蛹螺属部分种类ITS1的基因序列，没有该属种类COⅠ基因的序列）（表1）。
　　1.2 形态测量与比较
　　用游标卡尺（锡工牌0～150 mm）对2种各14只成体螺进行了测量。螺层数的计算采用Kerney等描述的方法[11]。贝壳照片用Nikon SMZ25数码体式显微镜拍摄。在Olympus SZ2-ILST解剖镜下对2种各3只成体螺进行软体解剖[12]及齿舌、颚片电镜样品制备[13-14]。生殖系统解剖图参考iphone手机拍摄的照片手绘完成。齿舌、颚片用LEO143OVT电子扫描显微镜扫描拍照。标本保存于新疆大学生命科学与技术学院。
　　1.3 分子分析
　　每种各3只标本，分别取腹足肌肉约30 mg，采用血液/细胞/组织基因组提取试剂盒（TIANGEN，北京）提取基因组DNA。线粒体COⅠ基因PCR扩增引物参照文献[15]：LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′），HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）;核基因内部转录间隔区ITS1基因PCR扩增引物参照文献[16]：ITS1L（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGAT-3′），58C（5′-TGCGTTCAAGATATCGATGTTCAA-3′），引物由北京华大基因公司合成。PCR反应体系为20.0 μL，其中包括2×Taq PCR Master Mix10.0 μL、7.0 μL ddH2O、正反向引物各0.5 μL、DNA模板2.0 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性1 min;94 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，运行35个循环;72 ℃延伸10 min。通过MEGA 5.0进行序列比对和编辑[17]，基于Kimura-2-parameter（K2P）模型进行遗传距离分析，采用邻接法（NJ）构建分子系统树，利用Sequin软件将序列上传至NCBI数据库中。 　　2 结果与分析
　　2.1 钻拟蛹螺Pseudonapaeus miser（Martens，1874）（图1，图2-a）
　　Buliminus miser Martens，1874：21-22，fig.17.
　　Pseudonapaeus miser（Martens，1874）Schileyko，1952：204，fig.117.
　　Pseudonapaeus miser（Martens，1874）陈德牛，1987：56，fig.67.
　　Pseudonapaeus miser（Martens，1874）Sysoev，2009：68-69，fig.29I.
　　Pseudonapaeus miser（Martens，1874）钱周兴，2013：56.
　　2.1.1 形态特征
　　贝壳：贝壳小型，壳质厚，坚实，不透明，呈蛹形。有5.1～6.0个螺层。壳高7.78～10.92 mm[（9.26±0.36） mm]，壳宽3.34～4.72 mm[（4.10±0.36） mm]，壳口高2.76～4.12 mm[（3.47±0.31） mm]，壳口宽2.14～3.34 mm[（2.74±0.32） mm]。壳面黄棕色或浅黄棕色、光滑、有光泽，具有不均匀分布的稀疏生长线和螺纹特点，壳顶钝、缝合线深，壳口呈椭圆形、口缘外折、脐孔狭小，呈缝隙状。壳口具3齿，为轴唇齿、腔壁齿、腭壁齿（图1-A至图1-E）。
　　齿舌：角质，长带状，其上具100～102行齿，齿式为（12～13） ∶（10～11） ∶1 ∶（10～11） ∶（12～13）。中央齿三锥型、主锥尖、呈菱形，明显长于基板（图1-F）。侧齿双锥型，主锥和外锥均比中央齿的大（图1-G）。缘齿双锥型，靠近外侧的缘齿外锥常分裂为2～4枚小齿（图1-H）。颚片小、几丁质、半月形、棕色，具明显的纵行肋纹（图1-I）。
　　生殖系统：阴茎圆柱状，较长，阴茎基背板中等长度，鞭状器退化几乎阙如，具盲突、阴茎附属器官各部分（A-1+A-2、A-3、A-4、A-5）均有发育。阴道短，阴道与游离输卵管长度比为1 ∶3。受精囊管长，受精囊无柄，少数质地较薄，受精囊管分支盲囊不膨大（图2-A）。
　　栖息环境：钻拟蛹螺生活在山区、丘陵地带灌木丛以及农田附近潮湿的草丛中，石块或落叶下，有时也躲在石缝里。本研究的标本采自海拔为700～900 m天然草场的草丛中。
　　2.1.2 分类学比较
　　本研究的标本贝壳形态及大小与文献中对钻拟蛹螺P.miser（Martens，1874）的描述[4-7，18]总体一致。但陈德牛等[5]和钱周兴等[7]描述的该种标本贝壳呈角褐色，与本研究的标本略有差异;钱周兴等描述的标本壳口具2枚齿[7]，与本研究的标本存在差异。本研究的标本贝壳形态与部分文献中的描述略有差异，但是与模式标本的描述总体一致，并且陆生贝类同种不同种群、不同个体间贝壳形态会存在一定的变化[19]，综合分析本研究的标本为钻拟蛹螺。
　　2.2 吐尔根拟蛹螺
　　新种Pseudonapaeus tuergenensis sp.nov.（图2-B、图3），正模标本：壳高9.42 mm，壳宽4.48 mm，壳口高3.52 mm，壳口宽3.38 mm。2015年4月21日采自新疆伊犁新源县吐尔根农场（83°20′E，43°32′N，海拔911 m），1只（XJU E.13001），采集人杨松。
　　副模标本：壳高9.42～11.12 mm[（10.14±0.62） mm]，壳宽4.48～5.9 mm[（5.10±0.40） mm]，壳口高3.52～4.60 mm[（4.06±0.30） mm]，壳口宽3.38～4.00 mm[（3.70±0.23） mm]，43只（XJU E.13002），采集信息同正模。
　　2.2.1 形态特征
　　贝壳：贝壳小型、壳质厚、坚实、不透明、呈塔形。有6.1～7.0个螺层，倒数第一、二螺层呈不均匀的灰白色或黄灰色，其余螺层呈浅棕色。壳面有光泽，具不均匀分布的稀疏生长线和螺纹;壳顶钝;缝合线深;壳口呈椭圆形，口缘向外扩大。脐孔狭小，呈缝隙状（图3-A至图3-D）。
　　齿舌：角质，长带状，其上具90～92行齿，齿式为（12～13） ∶（9～10） ∶1 ∶（9～10） ∶（12～13）。中央齿三锥型，主锥尖、呈菱形、略长于基板（图3-E）。侧齿双锥型，主锥和外锥均比中央齿的大（图3-F）。缘齿双锥型，靠近外侧的缘齿外锥常分裂为2～4枚小齿（图3-G）。颚片：小，几丁质，半月形，棕色，具纵行肋纹（图3-H）。
　　生殖系统：阴茎圆柱状，较短，阴茎基背板中等长度，鞭状器退化几乎阙如，具盲突。阴茎附属器官（A-1+A-2、A-3、A-4、A-5）均有发育。阴道长，阴道与游离输卵管长度比为1 ∶1.6。受精囊管中等长度，受精囊中等大小，椭球形，受精囊管无分支盲囊（图2-B）。
　　2.2.2 分类学比较
　　吐尔根拟蛹螺P.tuergenensis sp. nov.与新种钻拟蛹螺P.miser（Martens，1874）均分布于新疆伊犁，它们的生境，贝壳质地、大小和颜色及齿舌和颚片的形态结构相似。但钻拟蛹螺贝壳较小，呈蛹形，壳口具3枚齿，阴茎较长，阴道较短，受精囊管有分支盲囊。新种贝壳较大，呈塔形，壳口无齿，阴茎较短，阴道较长，受精囊管无分支盲囊，与前者差异明显[4，6-7]。
　　P.submucronatus（Lindholm，1927）分布于吉爾吉斯斯坦天山山脉，其贝壳呈塔形、壳口无齿，形态与新种相似。但P.submucronatus贝壳较大（壳高13～17 mm，壳宽7～9 mm），阴茎较长，鞭状器明显，阴道长（阴道与游离输卵管长度比为3 ∶1），受精囊管有分支盲囊，与新种差异明显[18]。由于缺少P.submucronatus的分子系统学数据，对于2种的比较有待进一步研究。 　　2.3 分子系统学分析
　　共测得10条基因序列，其中ITS1基因序列6条（钻拟蛹螺、吐尔根拟蛹螺各3条），有效长度为610 bp;COⅠ基因序列4条（钻拟蛹螺3条、吐尔根拟蛹螺1条），有效长度为651 bp，其中3条钻拟蛹螺COⅠ基因共享一个单倍型。8条序列上传至GenBank（MK131271～MK131276、MK138523～MK138524）。
　　基于COⅠ基因序列构建的系统发育树结果（图4）显示，新种和钻拟蛹螺以高支持率（后验概率96%）与其他各属种分开，形成一个单系（支系A），显示二者有密切的亲缘关系;但钻拟蛹螺3个个体以高支持率（后验概率100%）聚为一支，与新种产生分异。基于ITS1基因序列遗传距离的结果（表2）显示，新种与钻拟蛹螺之间的遗传距离为13.7%（12.5%～15.1%），显著高于种内遗传距离（吐尔根拟蛹螺种内遗传距离为2.5%（1.3%～3.5%），钻拟蛹螺的种内遗传距离为1.4%（1.2%～1.5%）且无重叠，显示二者之间的遗传分异已达到种的水平，为不同种。结合比较形态学的结果，进一步确定吐尔根拟蛹螺为一新种。
　　3 结论与讨论
　　Martens 1874年建立P.miser时将其归为Buliminus属，后Schileyko（1952，1998）基于生殖系统的特征将其移入Pseudonapaeus属（Pseudonapaeus属鞭状器退化几乎阙如、阴茎基背板具盲突、阴茎末端无膨大现象;而Buliminus属鞭状器长、阴茎基背板无盲突、阴茎末端膨大）。依据线粒体COⅠ基因序列构建的艾纳螺科7属9种间的系统发育树显示，本研究中P.miser和新种以高支持率（后验概率96%）形成支系A，与Buliminus属2种形成的分支明显分开，该结果支持P.miser不应隶属于Buliminus属。钻拟蛹螺在我国仅分布于新疆，该种的内部解剖结构和分子序列过去未见报道 本研究
　　首次对钻拟蛹螺生殖系统以及齿舌、颚片的形态结构进行了描述并对其线粒体基因（COⅠ）和核基因（ITS1）的DNA序列进行了报道，为该种的准确鉴定提供了更详尽的数据依据。
　　拟蛹螺属目前在我国仅有本研究报道的2种。该属分子数据贫乏，NCBI数据库中仅有该属4种4条ITS1基因序列数据，关于这2个种的系统发育位置有待后续研究。由于我国对该属缺乏系统的研究，该类群对新疆农牧区的危害情况尚属未知。本研究结果为进一步研究该类群的分类学、生物学、生态学和害虫防治提供了数据基础。
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