电针对脑卒中肢体痉挛大鼠皮质BDNF、TrkB 及GABAa表达的影响
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作者:谢志强 谢莉娜 郭斌 刘未艾 黄麟荇 王彭汉 岳增辉
摘要：目的 觀察电针对脑卒中肢体痉挛大鼠皮质脑源性神经营养因子（BDNF）、酪氨酸激酶受体B（TrkB）、γ-氨基丁酸（GABA）受体（GABAa）表达的影响，探讨电针治疗脑卒中肢体痉挛的机制。方法 将77只SD雄性大鼠随机分为空白组、假手术组各9只及模型储备组59只，运用Zea Longa线栓结合内囊注射NMDA受体制作脑卒中肢体痉挛大鼠模型。18只成模大鼠随机分为模型组、电针组。电针组取双侧阳陵泉、曲池针刺，每次30 min，每日1次，连续5 d;假手术组和模型组同期只固定不作任何干预，空白组不作任何处理。观察各组大鼠Zea Longa评分，改良Ashworth肌张力量表评分，皮质BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表达。结果 与空白组、假手术组比较，模型组和电针组大鼠治疗前行为学评分明显升高（P<0.01）;与模型组比较，电针组大鼠治疗后行为学评分明显降低（P<0.05）;与空白组、假手术组比较，模型组大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表达明显降低（P<0.05）;与模型组比较，电针组大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表达明显升高（P<0.05）。结论 电针可改善脑卒中肢体痉挛大鼠神经功能评分及肌张力，其机制可能与调节模型大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa表达相关。
关键词：电针;脑卒中;肢体痉挛;脑源性神经营养因子;酪氨酸激酶受体B;γ-氨基丁酸受体;大鼠
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2020）02-0023-05
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201905042
Effects of Electroacupuncture on Expressions of BDNF， TrkB and GABAa
in Cortex of Rats with Limb Spasm after Stroke
XIE Zhiqiang， XIE Lina， GUO Bin， LIU Weiai， HUANG Linxing， WANG Penghan， YUE Zenghui
College of Acupuncture and Massage， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China
Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture on the expressions of BDNF， TrkB and GABAa in the cortex of rats with limb spasm after stroke; To explore the mechanism of electroacupuncture in the treatment of limb spasm after stroke. Methods Totally 77 SD male rats were randomly divided into blank group （9 cases）， sham-operation group （9 cases）， and model reserve group （59 cases）. Rat model with limb spasm after stroke was prepared by using Zea Longa suture-occluded and injecting of NMDA receptor in inner capsule. Then， the successfully prepared 18 rats were randomly divided into the model group and the electroacupuncture group. In the electroacupuncture group， electroacupuncture was used to stimulate Yanglingquan （GB34） and Quchi （LI11） once a day for 30 min each time， for consecutive 5 d. The sham-operation group and the model group just fixed at the same time without any intervention， while the blank group received no treatment. Zea Longa score， the modified Ashworth Tension Scale， and the mRNA and protein expressions of BDNF， TrkB， and GABAa in the cortex were observed. Results Compared with the blank group and the sham-operation group， the behavioral score of model group and electroacupuncture group increased significantly （P<0.01）. After treatment， compared with the model group， the behavioral score of the electroacupuncture group decreased significantly （P<0.05）. Compared with the blank group and the sham-operation group， the mRNA and protein expressions of BDNF， TrkB， and GABAa in the cortex of the model group decreased significantly （P<0.05）， while the mRNA and protein expressions of BDNF， TrkB， GABAa in the cortex of the electroacupuncture group increased significantly compared with the model group （P<0.05）. Conclusion Electroacupuncture can improve neurological function score and muscle tone in rats with limb spasm after stroke， which may be through the regulation of cortical BDNF， TrkB， and GABAa. Keywords： electroacupuncture; stroke; limb spasm; BDNF; TrkB; GABAa; rats
脑卒中后80%～90%患者出现不同程度的肢体痉挛，严重影响患者的生存质量。肢体痉挛发生的物质基础是神经递质的失衡与紊乱[1]。兴奋性递质增加或抑制性递质减少均会引起和加重肢体痉挛。γ-氨基丁酸（GABA）作为抑制性递质的代表性物质，与其受体结合，产生突触前抑制作用，从而缓解肢体痉挛。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）与酪氨酸激酶受体B（tyrosibe kinase，TrkB）结合后，能促进GABA及其受体GABAa的表达。课题组前期研究显示，电针阳陵泉、曲池能改善脑卒中肢体痉挛大鼠肌张力，其机制与上调脑卒中肢体痉挛大鼠皮质GABA及其受体GABAb的表达有关[2]。本研究观察电针对脑卒中肢体痉挛大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa表达的影响，探讨电针治疗脑卒中肢体痉挛的相关机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
77只SD雄性大鼠，体质量200～240 g，购于湖南斯莱克景达动物实验有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于湖南中医药大学动物实验中心，温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%。随机分为空白组（9只）、假手术组（9只）、模型储备组（59只，造模成功后分为模型组和电针组，每组9只）。
1.2 主要试剂与仪器
水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司），NMDA受体（武汉华联科试剂公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型，Bioswamp，PAB180007），SYBR Green PCR试剂盒（KAPA Biosystems，KM4101），BDNF抗体（Abcam，ab108319），TrkB抗体（Abcam，ab18987），GABAa抗体（Bioss，bs-1232R）。大鼠脑立体定位仪（日本成茂公司，SN-2），SDZ-V电针仪（苏州医疗用品厂有限公司），0.30 mm×13 mm一次性针灸针（苏州医疗用品厂有限公司），酶标仪（芬兰雷勃公司，MK3），荧光定量PCR仪（Bio-Rad，CFX-Connect 96），超微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司，Nano-300），栓线（北京西浓科技有限公司，2838-50A4）。
1.3 造模
采用Zea Longa线栓法结合内囊注射NMDA受体制作脑卒中肢体痉挛模型[3]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉。将麻醉后大鼠固定在手术台，备皮消毒，沿颈部正中偏右切口，分离右侧颈总动脉和迷走神经后，分别在颈总动脉远心端、颈内动脉近心端、颈外动脉近心端备线，然后分别结扎颈外动脉近心端、颈总动脉远心端，动脉夹夹闭颈内动脉。在离颈总动脉分叉膨大处5 mm切口，将栓线经切口插入颈内动脉，松开动脉夹，栓线深度18～20 mm时稍感阻力停止插线。插线完毕后，将颈内动脉近心端和栓线一起结扎，逐层缝合切口，缝合处撒适量青霉素。大鼠清醒后通过神经功能评分判断造模是否成功。成模大鼠第2日行内囊注射NMDA受体。参照内囊电毁损法[4]。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠头顶部备皮，把5 μL微量注射器（内含NMDA受体）固定于大鼠脑立体定位仪。同时将大鼠俯卧固定于大鼠脑立体定位仪，使用定位辅助装置。沿颅顶矢状缝作纵行切口，长约2 cm，分离筋膜暴露前囟，手术钳向两侧拉开，暴露右侧顶骨和额骨交界骨缝。参照《大鼠立体定位图谱》[5]确定内囊位置，选择前囟后1.4 mm、矢状缝右侧2.4 mm，用小型电钻在颅板上钻一直径约2 mm小孔，将微量注射器垂直插入7 mm，缓慢注射5 μL NMDA受体，注射时间维持5 min。注射完毕后拔出微量注射器，用明胶海棉压迫止血，碘伏消毒，伤口局部撒青霉素，最后缝合。上述造模术后均按0.1 mg/kg剂量注射呋塞米，防止脑水肿。術后予葡萄糖水及饲料喂养，单笼饲养，保持呼吸道通畅。
假手术组线栓造模时仅分离颈总动脉、迷走神经、颈内外动脉，不进行插线及结扎;内囊注射NMDA受体造模时，内囊注射5 μL生理盐水，余步骤同模型组。
1.4 干预
电针组：造模成功后第1日，大鼠固定于鼠板，针刺双侧阳陵泉、曲池，穴位定位参照《实验针灸学实验指导》[6]，并结合解剖学方法进行大鼠穴位定位。阳陵泉：距后三里（在膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处）上外侧5 mm。曲池：桡骨近端的关节外侧前方凹陷。连接SDZ-V电针治疗仪，波型为密波，频率100 Hz，强度以大鼠肢体轻微抖动为度。每次30 min，每日1次，连续5 d。空白组不作任何处理，假手术组及模型组除与电针组同期只固定不进行任何干预。
1.5 行为学检测
分别在治疗前及治疗后参照Zea Longa标准进行神经功能评分[7]，1～3分提示模型成功。0分：无神经损伤症状;1分：不能完全伸展手术对侧前爪或后爪;2分：行走时向手术对侧转圈;3分：行走时向手术对侧倾倒;4分：不能自发行走，意识丧失。分别在治疗前及治疗后运用改良Ashworth肌张力量表进行肌张力评定[8]，1～4级提示模型成功。0级：无肌张力升高，大鼠活动自如;1级：轻度增加，抓握中被动屈伸至最后有小的阻力;1+级：轻度增加，抓握至一半运动半径以上有轻度阻力增加;2级：肌张力在大部分运动半径中都有较大增加，但肢体被动运动容易;3级：肌张力明显增高，被动活动困难;4级：受累部分肢体强直性屈曲或伸直。
1.6 标本采集
治疗第5日进行Zea Longa评分及改良Ashworth量表评分后，大鼠断头处死，剪开颅板，取脑组织，冰盘上取出患侧皮质，剥离后立即放入液氮速冻，-80 ℃保存，待测BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表达。 1.7 荧光实时定量PCR检测皮质脑源性神经营养因子、受体酪氨酸蛋白激酶和γ-氨基丁酸受体mRNA表达取样本匀浆20 s，迅速置于冰上，温育5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入氯仿，再离心10 min，取上清液，加异丙醇，离心10 min，弃上清液，沉淀，75%乙醇漂洗2次，7500 r/min离心5 min，加入DEPC水溶解RNA，得RNA溶液，之后进行总RNA中DNA、DNase1的消除，反转录完成后，将其产物进行PCR扩增。以β-actin作为内参，计算2-ΔΔCt值。引物序列见表1。
1.8 Western blot检测皮质脑源性神经营养因子、酪氨酸激酶受体B和γ-氨基丁酸受体蛋白表达
组织剪碎，按比例加裂解液（20 mg/150～250 μL），将匀浆后样品离心，取上清液，根据BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度，蛋白质定量贮存于-80 ℃冰箱备用。PAGE胶制备完成后，样品电泳，转膜，转膜完成后封闭，孵育一抗、二抗。最后待膜正面与ECL发光液充分接触后，置于全自动化学发光分析仪中检测，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。
1.9 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。符合正态分布的计量资料以—x±s表示，不符合正态分布的则以中位数和四分位间距[M（QR）]表示，多组计量资料比较，符合正态分布采用方差分析，不符合正态分布采用Kruskal-Wallis H检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般状况
模型储备组59只大鼠线栓造模死亡11只，死亡原因为麻醉失误、失血过多等;剩余48只清醒后进行Zea Longa神经功能评分，剔除0、4分大鼠6只，故通过评定符合模型成功标准共42只。成模大鼠进行内囊注射NMDA受体制作痉挛模型，手术过程中死亡21只，死亡原因为麻醉不当、固定不当、伤口感染、失血过多等;剩余21只大鼠清醒后进行改良Ashworth肌张力评定，剔除0级大鼠3只，共纳入18只大鼠。
2.2 电针对脑卒中肢体痉挛大鼠Zea Longa评分的影响
与空白组比较，假手术组治疗前大鼠Zea Longa评分无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），模型组、电针组大鼠Zea Longa评分明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），提示造模成功。模型组与电针组大鼠治疗前Zea Longa评分差异无统计学意义（P>0.05），具有齐同可比性;与模型组比较，电针组治疗后评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。
2.3 电针对脑卒中肢体痉挛大鼠改良Ashworth肌张力量表评分的影响
治疗前与空白组比较，假手术组大鼠Ashworth评分无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），模型组、电针组大鼠Ashworth评分均明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），提示造模成功。模型组与电针组大鼠治疗前Ashworth评分比较差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，电针组治疗后大鼠Ashworth评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3。
2.4 电针对脑卒中肢体痉挛大鼠皮质脑源性神经营养因子、酪氨酸激酶受体B和γ-氨基丁酸受体mRNA表达的影响
与空白组比较，假手术组大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa mRNA表达无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），模型组大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，电针组大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表4。
2.5 电针对脑卒中肢体痉挛大鼠皮质脑源性神经营养因子、酪氨酸激酶受体B和γ-氨基丁酸受体蛋白表达的影响
与空白组比较，假手术组大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），模型组大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，电针组大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表5。
3 讨论
脑卒中后高级中枢受损导致低级中枢处于失控状态，低级中枢α运动神经出现异常兴奋，从而出现肢体痉挛。GABA作为抑制性神经递质的代表，参与正常肌张力维持的过程，其与相应受体GABAa结合后，发挥其生物学效应，抑制低级中枢α运动神经元异常兴奋。BDNF作为神经营养因子家族成员之一，对大脑生理功能及突触相关功能产生重要影响[9]。脑卒中发生后，BDNF对神经起到保护作用，同时促进神经功能恢复[10]，并参与神经递质的调节。TrkB是BDNF的受体，两者结合具有高度特异性。研究表明，在磷酸肌醇3-激酶和蛋白激酶C的作用下，BDNF与TrkB结合后能增加GABA的表达，促进GABAa的表达。另有研究显示，衰老过程中BDNF分泌减少导致GABA表达下调，而给予外源性BDNF可上调GABAa的表达[11-12]。
脑卒中肢体痉挛属中医学“痉证”范畴，其发病部位在筋。《景岳全书》记载：“气中无血，则病为抽掣拘挛。”气血得荣，则筋脉濡养有道;气血津液亏虚不足，筋脉得不到滋养，则会引起筋脉挛缩。阳陵泉为筋会，主治筋病，《针灸聚英》有“主膝伸不得屈……偏风半身不遂……足筋挛”，具有舒筋、壮筋的作用。曲池为手阳明经合穴，阳明经多气多血。《内经》中“治痿独取阳明”为临床治疗中风的选穴依据，另《医宗金鉴》记载曲池“主治中风，手挛筋急”。基于上述理论，阳陵泉、曲池在脑卒中治疗肢体痉挛中广泛应用，并且两者能有效缓解脑卒中肢体痉挛[13-14]。 本实验结果显示，造模后大鼠行为学评分降低，经电针治疗后行为学评分增加，提示电针能有效改善脑卒中肢体痉挛大鼠神经功能及肌张力。另外，造模后大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa表達下降，与已报道的文献一致[15]。也有研究显示，脑卒中模型大鼠BDNF、TrkB表达升高[16-17]。分析本实验结果出现的原因可能是脑卒中发生后，神经元及星形胶质细胞受损，导致BDNF、TrkB分泌不足。经电针治疗后，大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa表达均升高。提示电针能上调脑卒中肢体痉挛大鼠皮质BDNF、TrkB、GABAa的表达。
综上，结合行为学及分子生物学结果，证实电针能有效改善脑卒中肢体痉挛，其具体机制可能是电针促进BDNF与TrkB的表达，两者结合后进一步促进GABAa的表达，GABAa表达的增加，增强其与GABA结合后产生的突触抑制作用，进而改善脑卒中后肢体痉挛状态。
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（收稿日期：2019-05-05）
（修回日期：2019-06-25;编辑：华强）
基金项目：国家自然科学基金（81673886）;湖南省自然科学基金（2018JJ2294）;湖南省中医药科研计划项目（201828）;湖南省研究生科研创新项目（CX2018B488）
通讯作者：岳增辉，E-mail：624755064@qq.com
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