何首乌“九蒸九晒”炮制工艺优选及对L02肝细胞生长的影响

来源:用户上传      作者:刘梦娇 蒲俊安 戴冰 杨全伟 张志国 杨磊

　　 摘要：目的  探索何首乌“九蒸九晒”最佳炮制工艺及不同炮制品对正常人L02肝细胞生长的影响。方法  选择蒸制时间、炮制次数、晒制时间3个因素，采用L9（34）正交试验，以二苯乙烯苷、游离蒽醌、结合蒽醌含量为考察指标，优选炮制工艺;以细胞抑制率为评价指标，考察何首乌不同炮制品对L02肝细胞生长的影响。结果  优选的何首乌“九蒸九晒”最佳炮制工艺为：蒸制4 h，晒制4 h，蒸晒11次。优选炮制品的肝细胞抑制率为2.86%，药典法炮制品的肝细胞抑制率为23.67%。结论  本研究优选的何首乌“九蒸九晒”炮制工艺结果可靠，评价指标可控，所得炮制品的肝细胞抑制率低于药典法炮制品。
　　 关键词：何首乌;九蒸九晒;正交试验;L02肝细胞
　　 中图分类号：R283.3;R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）04-0070-04
　　 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201904391
　　Optimization of Processing Technology of “Nine-time Repeat Steaming and Sun-drying Process” of Polygoni Multiflori Radix and Effects on L02 Hepatocytes
　　LIU Mengjiao1， PU Jun’an1， DAI Bing2， YANG Quanwei3， ZHANG Zhiguo2，4， YANG Lei2，4
　　1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 2. The First Hospital Affiliated to Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China; 3. The First Hospital of Wuhan City， Wuhan 430022， China; 4. ZHANG Zhiguo Heritage Studio Related to the Old Chinese Medicine Experts， Changsha 410007， China
　　 Abstract： Objective To explore the optimum processing technology of traditional “nine-time repeat steaming and sun-drying process” of Polygoni Multiflori Radix and the effects of different products on human normal L02 hepatocytes. Methods Three factors， such as steaming time， drying times and processing time， were selected. L9（34） orthogonal test was adopted， and TSG， free anthraquinones and combined anthraquinones were set as indicators for optimization of processing technology; the effect of different products of Polygoni Multiflori Radix on L02 hepatocytes was investigated by setting the inhibition rate as evaluation index. Results The optimum processing technology of “nine-time repeat steaming and sun-drying process” of Polygoni Multiflori Radix was steaming for 4 hours， drying for 4 hours and steaming for 11 times， and the inhibition rate of hepatocytes was 2.86%; the inhibition rate of hepatocytes of Pharmacopoeia processing method was 23.67%. Conclusion The optimum processing technology of “nine-time repeat steaming and sun-drying process” of Polygoni Multiflori Radix is reliable， and the evaluation index is controllable. The inhibition rate of hepatocytes is lower than that of the Pharmacopoeia method.
　　 Keywords： Polygoni Multiflori Radix; nine-time repeat steaming and sun-drying process; orthogonal text; L02 hepatocyte
　　 何首烏为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，生品主要功效为解毒、消痈、截疟、润肠通便，炮制品可补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂[1]。何首乌及其中成药应用非常广泛，但国内外有关何首乌致肝损伤事件频发[2]，其肝毒性物质研究主要集中于二苯乙烯苷类及蒽醌类成分[3-4]。“九蒸九晒”是何首乌的经典炮制方法，从宋代沿用至明、清，鲜有毒性记载[5]。今多简化，2015年版《中华人民共和国药典》制何首乌的炮制方法要求“蒸至内外呈黑褐色”。古今炮制方法的差异可能是其临床毒副反应发生的重要因素之一。有学者对其古今炮制方法进行相关研究，探讨了肝毒性物质基础及其潜在影响因素[6-7]。本研究采用正交试验法对何首乌“九蒸九晒”古法炮制工艺进行优选，并考察古法“九蒸九晒”与药典法炮制品对正常人L02肝细胞活性的影响，为规范何首乌炮制工艺及质量标准的制定提供参考。 　　1  仪器与试药
　　 Agilent 1260型高效液相色谱仪（德国安捷伦科技公司），AR2140型电子分析天平（上海海鸿精密仪器有限公司），Galaxy170R型恒温培养箱（海跃进医疗仪器厂），SW-CJ-2G超净工作台（美国Thermo Scientific公司），ELx800酶标仪（美国BioTek公司），Primo Vert型荧光倒置显微镜（北京瑞科中仪科技有限公司），5804R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。
　　 何首乌（批号20182019），湖南南国药都中药饮片有限公司，经湖南中医药大学第一附属医院张志国教授鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根;黑豆，市售;二苯乙烯苷对照品（批号110844-201512）、大黄素对照品（批号0756-9908），中国食品药品检定研究院;大黄素甲醚对照品（批号MUST-12022005），成都曼思特生物科技有限公司;正常人L02肝细胞，上海生博生物医药公司;高糖DMEM培养基，上海立菲生物技术公司;胎牛血清、PBS，美国Gibco公司;DMSO，美国Amresco公司;胰酶，北京Solarbio公司;CCK-8试剂盒，七海生物公司;乙腈、甲醇、乙醇为色谱纯，水为纯水，其他试剂为分析纯。
　　2  方法与结果
　　2.1  二苯乙烯苷含量测定
　　2.1.1  色谱条件
　　 色谱柱为Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（25∶75），检测波长320 nm，流速1 mL/min，进样量10 ?L，柱温30 ℃。
　　2.1.2  对照品溶液制备
　　 精密称取二苯乙烯苷对照品适量，用稀乙醇溶解，制成0.21 mg/mL的溶液，即得。
　　2.1.3  供试品溶液制备
　　 精密称取正交试验炮制的9份何首乌样品粉末各0.2 g，按2015年版《中华人民共和国药典》（一部）何首乌含量测定二苯乙烯苷项下方法制备，即得。
　　2.1.4  样品含量测定
　　 按“2.1.1”项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 ?L进样测定，色谱图见图1。
　　2.2  蒽醌类含量测定
　　2.2.1  色谱条件
　　 色谱柱为Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.1%磷酸溶液-甲醇（20∶80），检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量10 ?L，流速1 mL/min。
　　2.2.2  对照品溶液制备
　　 分别精密称取大黄素甲醚和大黄素对照品适量，用甲醇溶解，制得浓度分别为大黄素0.54 mg/mL、大黄素甲醚0.85 mg/mL的溶液，即得。
　　2.2.3  供试品溶液制备
　　 精密称取正交试验炮制的9份何首乌样品粉末各1 g，按2015年版《中华人民共和国药典》（一部）何首乌含量测定结合蒽醌项下方法制备，即得。
　　2.2.4  样品含量测定
　　 按“2.2.1”项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 ?L进样测定，色谱图见图2。结合蒽醌含量=总蒽醌含量-游离蒽醌含量。
　　2.2.5  正交试验
　　 根据文献及前期研究结果[8-10]，对炮制次数（A）、蒸制时间（B）、晒制时间（C）进行考察，各因素选取3个水平，以何首乌质量指标性成分二苯乙烯苷、游离蒽醌及结合蒽醌含量作为评价指标，采用综合评分法进行评价。根据各成分对何首乌功效的作用大小设计权重，二苯乙烯苷、游离蒽醌及结合蒽醌权重系数分别为0.60、0.20、0.20。综合评分=（该组二苯乙烯苷含量×60÷二苯乙烯苷最高含量）+（该组游离蒽醌含量×20÷游离蒽醌最高含量）+（该组结合蒽醌含量×20÷结合蒽醌最高含量）。因素水平见表1。分别取何首乌200 g，按正交设计进行试验，测定指标成分含量，结果见表2，方差分析见表3。从表2直观分析可以看出，在所选因素水平范围内，何首乌炮制工艺的影响因素为B>A>C，即蒸制时间>蒸制次数>晒制时间。从方差分析结果可以看出，三者均为显著影响因素。由直观分析结果可见，炮制次数因素各水平影响顺序为A3>A2>A1，蒸制时间因素各水平影响顺序为B2>B3>B1，晒制时间因素各水平影响顺序为C2>C3>C1，考虑试验时间及节省能源，将A3B2C2定为最佳炮制工艺条件，即蒸制4 h，晒制4 h，蒸晒11次。
　　2.3  不同炮制品对正常人L02肝细胞活性的影响
　　2.3.1  细胞培养
　　 取正常人L02肝细胞，在37 ℃、5%CO2条件下，培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，待细胞密度至80%～90%时，按1∶2比例进行传代，平均2～3 d传一代，取對数生长期细胞进行实验。
　　2.3.2  含药培养液的制备
　　 取何首乌生品、药典法（2015年版《中华人民共和国药典》）炮制品及正交试验优选工艺炮制品粉末，过4号筛，每组样品约20 g，精密称量，精密加入70%乙醇120 mL，称定质量，加热回流0.5 h后立即冷却，用70%乙醇补足减失的质量，过滤，浓缩并回收乙醇，浓缩液转移至10 mL容量瓶并定容，得2 g/mL的药液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。
　　2.3.3  细胞生长抑制率测定
　　 采用CCK-8法，将肝细胞接种于96孔板上，培养24 h后用于实验。空白组予空白培养液，生品组予何首乌生品培养液，优选组予正交试验优选炮制品培养液，药典组予药典法炮制品培养液，给药浓度依次为40、20、10 mg/mL。每个样品设6个复孔，周围孔用等量PBS填充以减少边缘效应，培养24 h后吸去培养基，PBS清洗3遍，每孔加入含CCK-8试剂10 μL的培养液100 μL，37 ℃、5%CO2继续孵育4 h，用酶标仪测定波长450 nm处吸光度（OD值），计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（实验组OD值-空白组OD值）÷空白组OD值×100%。结果见表4。 　　3  讨论
　　 “九蒸九晒”是中药材传统炮制方法，常用于何首乌、地黄、黑芝麻等炮制。“九”在古代有多种含义，除9次外，也可表示多次、长时间。本课题组查阅古代文献，何首乌“九蒸九晒”炮制方法蒸晒次数多在7～12次，故本试验将蒸制次数设定为5、8、11次3个水平。何首乌主要采用黑豆作为辅料进行炮制，古籍中蒸制时间多以“豆烂”“豆熟”为度，暴晒时间多以“晒干”表述，课题组前期研究表明，连续常压蒸制2 h即可达到豆熟程度，6 h达到豆烂程度，综合考虑选择蒸制时间分别为2、3、4 h。另外根据实际情况，晒制4 h即可达到晒干程度，再结合古代文献记载，选择晒制时间为4、6、8 h。
　　 现代研究表明，何首乌中二苯乙烯苷、蒽醌类成分对肝细胞有一定损伤作用[11-14]，这两类成分也是《中华人民共和国药典》何首乌质量控制的指标成分，故本研究采用该两类成分作为考察对象。在设定的工艺参数范围内，所有炮制品既符合传统“九蒸九晒”炮制工艺，也符合药典规定的质量要求。
　　 本研究采用优选的炮制工艺和药典方法炮制的何首乌进行正常人L02肝细胞活性实验，结果显示，优选炮制品的肝细胞抑制率更低，表明其对肝细胞的损伤小。结合前期化学成分研究[6]，表明二苯乙烯苷、结合蒽醌含量与肝细胞抑制率变化趋势一致，提示这2种成分可能是何首乌肝毒性物质基础。本课题组今后将进一步探索炮制过程-化学成分-肝毒性的关系。
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　　（收稿日期：2019-04-26）
　　（修回日期：2019-05-16;編辑：陈静）
　　基金项目：国家自然科学基金（81804075）;湖南省自然科学基金（2017JJ3247）;湖南省发改委基金（[2016]518）
　　通讯作者：杨磊，E-mail：yanglei30@sohu.com
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