不同分子量壳聚糖对大鼠肝脏止血和生物相容性的影响

来源:用户上传      作者:陈晶晶 竺静

　　摘要 [目的]探究壳聚糖的分子量对其止血和生物相容性方面的影响。[方法]选取分子量约1万、5万、10万Da的壳聚糖（脱乙酰度>90%）为研究对象，建立大鼠肝創面模型，进行肝组织HE染色、PCNA免疫组化试验和扫描电镜观察。[结果]壳聚糖各组止血的时间比模型对照组明显缩短且组织粘连程度轻（P<0.05），分子量对壳聚糖止血时间和减轻粘连方面影响差别不显著（P>0.05）。壳聚糖各组均能引起肝细胞水肿，其中，分子量5万Da组影响程度最小，分子量1万Da组最大。分子量5万Da壳聚糖组肝细胞增殖活跃且电镜下肝细胞结构轮廓清晰，细胞核完整，细胞器良好;分子量10万Da组壳聚糖肝细胞轮廓模糊，细胞核有变性、损伤;分子量1万Da壳聚糖组增生活跃、轮廓大体清楚，线粒体水肿严重，内质网扩张和断裂。[结论]分子量5万Da壳聚糖对大鼠肝脏组织止血效果和生物相容性较好。
　　关键词 壳聚糖;分子量;生物相容性;止血;大鼠肝脏
　　Abstract [Objective] The research aimed to explore the effect of molecular weight of chitosan on hemostasis and biocompatibility.[Method] Chitosan （deacetylation degree > 90%） with a molecular weight of about 10 000，50 000，100 000 Da was selected to establish a rat model of liver wound，HE staining，PCNA immunohistochemistry and SEM observation of liver tissue were carried out.[Result]The hemostasis time of each group was significantly shorter than that of the model control group （P<0.05），the molecular weight had no significant effect on hemostasis time and adhesion reduction of chitosan （P>0.05）.Among them，the effect of molecular weight 50 000 Da group was the least，and that of molecular weight 10 000 Da group was the most serious.Under the electron microscope，the hepatocytes of chitosan group with a molecular weight of about 50 000 Da proliferated actively，and the outline of the structure of hepatocytes was clear，the nucleus was complete，the organelles were good，the outline of the hepatocytes of chitosan group with a molecular weight of 100 000 Da was fuzzy，the nucleus was denatured and damaged，the proliferation of chitosan group with a molecular weight of 10 000 Da was active，the outline was generally clear，the mitochondria were seriously swollen，the endoplasmic reticulum was expanded and broken.[Conclusion]The chitosan group with a molecular weight of 50 000 Da is ideal for hemostasis and compatibility of liver tissue in rat.
　　Key words Chitosan; Molecular weight;Biocompatibility; Hemostasis;Rat liver
　　壳聚糖（chitosan，CTS），化学名称为 β-（l，4）-2- 乙酰氨基 -2- 脱氧 -D-葡聚糖，是一种来源于虾、蟹壳的天然有机高分子多糖，具有良好的生物相容性和物理化学特性，并具有抗炎、抑菌、促进创面修复、减少瘢痕增生等生物活性[1-5]，是由甲壳素（化学式N-乙酰-2-氨基-2-脱氧葡聚糖）在碱性条件下部分脱乙酰化后得到酸溶性物质。通常，乙酰基脱度大于50%的甲壳素，被称之为壳聚糖，或者说能在 1%乙酸或 1%盐酸中溶解 1%的脱乙酰甲壳素，称之为壳聚糖[6-7]。壳聚糖可以在体内降解，首次可降解成寡聚糖，进一步水解，通过代谢转化成糖蛋白，以不同方式代谢并排泄[8-9]，因此壳聚糖对人体无毒，相对安全，用途广泛。食品方面如食品保鲜、食用膜及增稠剂等方面有大量研究[10-12]。在生化、生物医学和医药等领域的应用取得重大进展，壳聚糖具有良好抗菌性、抗肿瘤活性，可用于促进伤口愈合、预防脑血管疾病[13]。壳聚糖具有生物相容性和止血作用，多用于止血材料的应用和研究[14-16]。目前认为壳聚糖的止血原理是血液中带负电荷的红细胞、白细胞、血小板等与其相结合，形成细胞栓子或凝血栓产生凝血作用相关[17-21]。而分子量、脱乙酰度和外观形态是影响壳聚糖止血效果和生物相容性的主要因素[22]，李训虎等[23]研究指出壳聚糖的分子量差异对体外培养Hela细胞生长有影响。目前有关壳聚糖的分子量差异对体内组织的研究报道不多，笔者通过研究3种不同分子量壳聚糖（脱乙酰度>90%）在大鼠体内对肝细胞的影响，来评价分子量差异对壳聚糖的止血性能和生物组织相容性的影响。 　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料 壳聚糖粉（脱乙酰度>90%），安徽博美生物科技有限公司;戊巴比妥钠，上海榕柏生物技术有限公司;成年健康SD大鼠，重190～210 g，60只， 雌雄不限 ，广东维伯鑫生物科技有限公司（SCXK（粤）2016-0041）; PCNA试剂盒，武汉纯度生物有限公司;电子天平，德国Sartorius 公司。
　　1.2 试验方法 将SD大鼠随机分成4组，每组15只，A组为模型对照组，B组为分子量10万Da壳聚糖组;C组为分子量5万Da壳聚糖组，D组为分子量1万Da壳聚糖组。
　　1.2.1 肝创面模型建立和止血时间测定[24]。将各组大鼠用3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行腹腔注射、麻醉、固定、消毒，沿腹中线剪开皮肤，逐层进入腹腔，充分暴露肝脏中叶。用无菌纱布吸净周围的腹腔液，在肝中叶远端，切取一长1 cm的切口。利用无菌纱布擦拭血液，B～D 组大鼠取等量壳聚糖粉（200 mg）进行切口撒粉止血，A组不做止血处理，分别观察和记录止血时间。出血停止后，缝合，饲养。
　　1.2.2 材料代谢及组织形态学试验[25]。术后1周、2周、3周、4周、6周，每组取3只大鼠，3%戊巴比妥钠注射致死，沿原切口打开腹腔，观察肝创面切口的愈合情况、局部反应及材料的代谢吸收情况。4周时取肝创面标本，戊二醛固定，依次用酒精梯度脱水，石蜡固定，切片，厚度为1 μm，做 HE染色。按上述方法进行取材、固定、脱水，石蜡固定，切片，用大鼠抗增殖细胞核抗原（PCNA）进行免疫组织染色，观察新生的肝细胞情况。同时取肝创面组织，用戊二醛固定、干燥、样品装台，使用扫描透射电子显微镜观察肝组织细胞微观情况。
　　1.3 数据处理 用SPSS 18.0软件对试验数据进行统计学分析，显著性水平设置为P<0.05，数据结果取平均值±标准差。
　　2 结果与分析
　　2.1 止血时间测定
　　根据大鼠止血时间测定得知，各组大鼠处理后，A组大鼠肝脏切口未做任何处理，创面止血时间较长，时间长达（258.5±1.2）s，缝合处理后，还有少量血液流出。B～D组，出血时间之间差异不显著，但与A组相比，止血时间明显缩短（P<0.05）。切口撒上壳聚糖粉后，粉末很快凝集，逐渐形成凝胶状堵塞出血口，血液慢慢停止流动。
　　2.2 术后各组大鼠腹腔观察
　　术后观察，A组：腹腔内，1～6周不同程度的粘连，大鼠肝脏与附近的器官粘连一起，不易分开。B～D组：1～6周腹腔粘连相对较轻，较容易与周围粘连脏器分开，创面的愈合良好，随着时间推移，炎症反应逐渐减轻，4周无明显炎症，6周恢复正常组织状态;1～4周，壳聚糖粉吸收情况观察，D组>C组>B组;6周，B组有少量残留，C、D组基本吸收完全。
　　2.3 HE染色 从A～D组大鼠术后4周肝脏HE染色后肝脏组织学结构（图1）可以看出，A组肝细胞基本完整，局部有坏死，有炎性细胞浸润，细胞有水肿;B组肝细胞水肿，炎性细胞浸润，新生肝细胞较少;C组肝细胞结构基本正常，有新生肝细胞，轻度水肿;D组肝细胞结构正常，无炎性细胞浸润，水肿程度重。
　　2.4 免疫组化
　　从A～D组大鼠术后4周采用PNCA免疫组化后高倍镜观察情况（图2）可以看出，A组，新生肝细胞较少，局部坏死细胞较多;B组肝细胞结构基本正常，局部变性，炎性细胞浸润，局部有坏死病灶，肝细胞水肿;C组肝细胞结构正常，肝细胞轻度水肿;D组新生肝细胞较多，局部有水肿。
　　2.5 透镜观察 从图3可看出，
　　A组，肝细胞结构轮廓清晰，完整，细胞核圆形，有肝细胞出现细胞核萎缩现象和消失，正常肝细胞核内染色均匀，细胞质染色均匀，内质网和线粒体分布均匀、丰富。B组肝细胞结构大体轮廓清楚，水肿、坏死，细胞核圆形或椭圆形，有变形或破损、浓缩，核内染色质均匀，细胞质器官分布不均，线粒体肿胀，内质网扩张。C组肝细胞结构大体轮廓清晰，肝细胞水肿较轻，细胞核圆形、椭圆形，染色均匀，无破损，细胞基本分布均匀，线粒体轻度水肿，内质网增生，核糖体增加。D组肝细胞结构大体轮廓模糊，细胞之间界限不清晰，细胞核圆形，无破损，核内物质均匀，细胞器肿胀明显，内质网扩增，出现断裂，不連续现象。
　　3 结论与讨论
　　该试验通过创建鼠肝脏模型，观察肝脏组织HE染色、PCNA免疫组化和电镜变化，探究1万、5万、10万分子量的壳聚糖对肝组织的影响。在肝脏创面止血过程中发现，壳聚糖粉末撒在各组创面伤口后，粉末立即溶于血液，凝集成半凝胶状，止血时间明显缩短。关于壳聚糖的止血原理尚未明确定论，国外早期研究者Davle、Ratnof、Macfadane 在1964年提出了血液凝固的瀑布机制，他认为壳聚糖的凝血主要是通过激活外源性凝血途径实现的，对补体系统旁路途径基本上没有激活作用，糖链上的氨基在凝血过程中同样也起了重要作用，另外壳聚糖吸取血液形成膜状，能吸附大量的血清蛋白促进止血[26]。
　　余雪松等[27]研究认为壳聚糖粉末能够迅速吸收血液中水分，膨胀，称水凝状，阻塞出血点，另外血液中凝集因子浓度增加，启动内源性凝血因子，加速凝血。何静等[28]研究指出壳聚糖游离的氨基引起内源性止血途径的激活，同时引起血小板聚集活化及红细胞的激活。另有研究认为壳聚糖的凝血机制与自身携带正电荷有关[29]，壳聚糖是一种碱性多糖，主要是由葡萄糖胺聚合而成，具有2个主要的活性基团（-NH2和-OH），与细胞黏附和生长的影响较大可能是壳聚糖的氨基（-NH2）基团。壳聚糖含有大量自由的氨基 （-NH2），这些氨基可以转化成阳离子（-NH3+），因此，壳聚糖可以通过电荷作用吸附表面带负电荷的白细胞、红细胞，从而增强了壳聚糖与细胞的黏附作用。
　　观察各组大鼠术后腹腔，均出现不同程度的粘连，模型对照组程度最重，壳聚糖各组较轻，说明壳聚糖能够减轻组织粘连。防止组织粘连可能是因为壳聚糖能够选择性促进组织细胞生长且能抑制纤维细胞增生，抑制胶原纤维分泌形成疤痕组织，减少组织粘连。壳聚糖通过局部止血，抑制纤维蛋白束形成，从而减少了因血肿机化吸收造成的组织粘连。粉末通过吸水膨胀于周围，阻止组织粘连发生。综合因素作用下有效减轻组织的粘连[30-31]。大体观察壳聚糖各组粘连情况区别不大，分子量并不是壳聚糖减轻组织粘连作用的主要因素。 　　在大鼠肝创面止血时间测定中，壳聚糖各组之间相比，止血时间差异不显著（P>0.05），但各组止血时间均明显小于模型对照组（P<0.05），说明壳聚糖具有明显的止血作用，其分子量并不是影响其止血性能的主要因素。
　　通过HE染色、PCNA免疫组化观察，分子量越小，对肝细胞增生影响效果越大。Juthamas等[32]将脂肪间质干细胞和骨髓间质干细胞在壳寡聚糖膜（分子量为1.4 kDa）和壳聚糖膜（分子量为1 000 kDa）上培养，结果显示，细胞在壳寡聚糖上的黏附面积和增殖能力分别是在壳聚糖上的6～7倍和30%左右，可见壳聚糖的分子量差异对细胞的活性产生影响。细胞活性主要是指细胞的存活、增殖、分化、迁移或是介质的释放等，主要是通过细胞膜上受体分子感知基质的表面性质，同时，细胞也会对基质的这些性质做出相应的反应来实现[33]。壳聚糖的分子结构与糖胺聚糖相似，而糖胺聚糖作为一类生物大分子，在基膜和胞外基质中广泛存在，有着重要的细胞活性功能[34]。壳聚糖在肝细胞表面，具有糖胺聚糖的相似功能，可能是分子量越小，壳聚糖更容易黏附在肝细胞表面，刺激细胞存活、增殖等活性，因此1万分子量壳聚糖的肝细胞表现增生活跃。
　　电镜观察肝细胞发现，10万分子量组和1万分子量组细胞受损较重，5万分子量组肝细胞受损最轻。可能是大分子量壳聚糖黏附在肝细胞表面，造成细胞外渗透压大于细胞内渗透压，细胞内失水，部分细胞脱水凋亡。1万分子量壳聚糖分子量较小，分解产物较易大量进入细胞内，渗透压大幅度增加，细胞器过度增生，导致细胞水肿，部分超过了细胞自身调节功能，将会造成细胞受损。5万分子量的壳聚糖对肝细胞在细胞表面对细胞内外渗透压影响相对不大，造成轻度水肿，随着细胞自身调节功能可能会进一步缓解;另外分解产物一部分进入细胞内，可适度刺激细胞器的增生。综上考虑，5万分子量壳聚糖生物相容性最好。
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