不同浓度NaCl溶液对四川裂腹鱼精子活力的影响研究

来源:用户上传      作者:刘桂兰　周礼敬　杨林　詹会祥　王朝荣

　　摘 要：通過开展0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%等不同浓度的NaCl溶液对四川裂腹鱼成熟精子活力的影响研究，结果表明，在NaCl溶液浓度为0.2%～0.8%的范围内，随着浓度的升高，精子剧烈运动的时间和寿命时长均与NaCl浓度呈正相关;当浓度为0.8%时达到最大值，精子剧烈运动时间平均达35″63，平均寿命78″20;之后随着NaCl浓度增加，精子剧烈运动时间和寿命时长均与药物浓度呈负相关状态。在人工繁殖时用浓度为0.8%NaCl溶液激活精子受精，平均受精率达到86.57%，比用养殖用水激活精子时的受精率高出22.11%，可大幅度提高四川裂腹鱼的人工繁殖受精率。
　　关键词：四川裂腹鱼;NaCl;精子活力;受精率
　　中图分类号 S962.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）08-0067-03
　　四川裂腹鱼（Schizothorax kozlovi）是长江上游特有的鱼类[1]，也是产区重要的经济鱼类，主要分布在长江上游的乌江、金沙江、雅砻江水系。近年来，受过渡捕捞、水环境污染、水工建筑等的影响，野生种群数量及分布区域急剧减少，渔获物个体趋于低龄化、小型化、低质化。开展该鱼类人工繁殖技术、基础生物学特性的研究，已成为业内研究的热点之一。目前，对四川裂腹鱼的研究主要集中在繁殖力[2]、肌肉营养成分[3]、人工繁殖和苗种培育[4]、亲鱼培育[5]等方面，而关于其精子活力的研究还尚未见报道。
　　受精是鱼类人工繁殖技术的关键点之一，如何提高受精率，为养殖生产带来更大的经济效益，已成为水产界的主要研究方向。影响鱼类受精率的因素很多[6]，精子活力就是其中之一。用NaCl溶液激活精子活力目前在虹鳟、鲤鱼、团头鲂、白点鲑、美国大口胭脂鱼、光唇鱼、半刺厚唇鱼、兴国红鲤等鱼类[7-13]中应用研究较多，而在裂腹鱼种类的研究还未见报道。为此，本研究以四川裂腹鱼作为试验材料，观察不同浓度的NaCl溶液对四川裂腹鱼精子活力的影响，筛选使精子剧烈运动时间最长、寿命最大时的NaCl溶液浓度，并应用于生产实践，以期大幅度地提高四川裂腹鱼的人工繁殖受精率。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料 四川裂腹鱼雌雄亲鱼均来自毕节市鑫有公司双坪养殖基地水泥池养殖的成熟亲鱼。NaCl购于山西同杰化学试剂有限公司生产，分析纯。用蒸馏水配制不同浓度梯度即0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，对照实验组为养殖场用水。观察精子活力时采用三目生物显微镜（型号：BM2100）;在体式显微镜（型号：ZX-606M）下观察四川裂腹鱼的受精情况。
　　1.2 方法
　　1.2.1 采集精液及精子活力的观察 每次取材时，擦干鱼生殖孔周围的水分，采用头高尾低的姿势，由前向后轻压腹部，将精液挤入事先清洁好的培养皿中，取中段精液观察，精液要求呈乳白色，无血无粪便污染。将载玻片置于16×40倍的电子显微镜下，分别用吸管吸取下列溶液一滴于载玻片上：养殖用水、0.2%NaCl、0.4%NaCl、0.6%NaCl、0.8%NaCl、1.0%NaCl、1.2%NaCl。然后用解剖针挑取少许新鲜精液与玻片上的溶液混合。混合开始后立即采用秒表计时，观察一个视野，精子活动等级参照吴景贵[14]之标准，即精液与溶液混合开始到75%的精子转为中速运动的时间为剧烈运动时间，计时起到95%的精子停止运动时间为精子的寿命。每个溶液浓度用同一样本分别做5次平衡实验，取平均值分别得到精子的剧烈运动时间和寿命时间。
　　1.2.2 人工受精及受精率统计 采用人工干法授精的方式[15]：授精时将雌鱼腹部水分擦干，用毛巾包裹雌鱼，采用头高尾低的姿势，轻压腹部将卵挤入清洁盆中;随即用相同手法将雄鱼挤出精液，快速搅拌精、卵，使之充分混合。每组随机取1份加入500mL养殖用水激活精子，其余部分随机分成3份分别用500mL的0.8%NaCl溶液激活精子。激活精子后晃动1～2min，室内静置5min后洗卵。受精率的统计选择在胚胎发育到原肠中期时，用小网随机捞取鱼卵100粒左右放在培养皿中，在体式显微镜下观察，受精率统计参照危起伟等[16]方式进行。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同浓度NaCl溶液对精子活力的影响 记录在室温18～20℃下采用不同浓度NaCl溶液激活精子，镜下观察记录精子的剧烈运动时间和寿命时间（见表1）。由表1可知：在采用养殖用水激活时，精子的剧烈运动时间和寿命时间分别是22″49和62″57;在用0.8%NaCl浓度激活时，精子剧烈运动时间和寿命时间均达到最高值，分别为35″63和78″20。而其他浓度的NaCl溶液对四川裂腹鱼精子活力的影响均低于0.8%时。
　　表1 不同浓度NaCl溶液的精子活力
　　[NaCl浓度 观察次数 剧烈运动的平均时间（s） 平均寿命（s） 对照组 5 22″49 62″57 0.2%NaCl 5 17″88 40″82 0.4%NaCl 5 20″58 45″25 0.6%NaCl 5 23″20 70″49 0.8%NaCl 5 35″63 78″20 1.0%NaCl 5 20″82 40″92 1.2%NaCl 5 15″26 25″33 ]
　　2.2 不同浓度NaCl溶液对受精率的影响 取同批次精卵，在相同环境条件下，分别用养殖用水和0.8%NaCl溶液激活精子受精，在胚胎发育到原肠中期时测定受精率，结果见表2。由表2可知：0.8%NaCl溶液激活下的平均受精率为86.57%，养殖用水激活下的受精率为66.46%。
　　3 结论与讨论
　　3.1 精子活力 鱼类精子在精巢和精液原浆中是不活动的，当遇水或其他可激活物质时便开始剧烈活动，随着时间延续，其自身储存能量逐步消耗直至殆尽，生命终止。精液中含有钠、钾等金属元素，钠是其中主要起稳定渗透压作用元素之一，对精子的激活和抑制有着非常重要的作用[17]。目前，已有大量的研究报道[10-13]指出，精子运动时间和寿命，与其所处介质的渗透压环境有关，当外界渗透压和其自身渗透压相一致时，其寿命时间及剧烈运动时间达最大值，低于或高于精子本身的渗透压，精子的运动都会受到不同程度的抑制。 　　罗芬等[11]通过对宽口光唇鱼精子活力的研究，结果表明，当NaCl浓度为0.51%时，其精子的剧烈运动时间和寿命最长;张艳萍等[7]通过对虹鳟精子的活力研究，结果表明，3龄虹鳟精子在0.8%的NaCl溶液中，其精子活力达到最高，当高于此浓度时，精子的活力受到抑制;刘丽丽等[12]对半刺厚唇鱼精子活力研究时得出，在NaCl浓度为0.7%时，其精子剧烈运动时间和寿命时间都是最长的。本试验研究了0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%等不同浓度的NaCl溶液激活四川裂腹鱼精子时，观察记录其精子剧烈运动时间和寿命，结果显示，在NaCl溶液浓度0.2%～0.8%范围内，随着浓度升高，精子剧烈运动时间和寿命时长均与NaCl浓度呈正相关状态，且浓度为0.8%时达到最大值，之后随着NaCl浓度增加，精子剧烈运动时间和寿命时长均与药物浓度呈负相关状态。延长精子剧烈运动时间在生产中具有实践意义，在此时间内更具有有效的受精能力[18]。因此，在进行人工繁殖时，采用0.8%NaCl溶液激活精子，在时间上为四川裂腹鱼受精提供了更多机会，从而提高了受精率。
　　3.2 受精率 多年研究表明，四川裂腹鱼在人工养殖条件下不能自然繁殖，人工繁殖是实现其种群规模扩大、满足养殖需求的有效方法。已有研究表明，四川裂腹鱼在人工繁殖时，采用养殖用水激活精子，其受精率最高仅为75.4%，平均为66.3%。本试验在人工繁殖时采用浓度为0.8%NaCl溶液激活四川裂腹鱼精子，精子剧烈运动时间平均达35″63，平均寿命78″20;而对照试验用养殖用水激活四川裂腹鱼精子时，精子剧烈运动时间平均仅为22″49，平均寿命62″57。用浓度为0.8%的NaCl溶液激活四川裂腹鱼精子受精，最高受精率达93.02%，最低受精率83.63%，平均受精率86.57%，明显高于采用养殖用水激活精子时的受精率。受精率高低除与卵子质量有关外，还与受精时精子剧烈运动时间、寿命有关，剧烈运动时间越长，将具有更强的竞争力，受精效果越好。
　　在常用的K+、Mg2+、Ca2+、Na+、葡萄糖、ATP等因子用于激活鱼类精子时获得更长剧烈运动时间及更长寿命周期，是否也适用于四川裂腹鱼还有待进一步研究。
　　参考文献
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　　（责编：张宏民）
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