基于网络药理学和生物信息学研究麻黄附子细辛汤治疗类风湿关节炎的潜在机制

来源:用户上传      作者:袁如月 许波

　　【摘 要】目的：基于网络药理学和生物信息学挖掘麻黄附子细辛汤治疗类风湿关节炎的潜在作用机制。方法：采用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）筛选各味中药的入血活性成分和预测潜在的作用靶点，基于Gene Expression Omnibus（GEO）数据库和DisGENET数据库检索类风湿关节炎相关的靶点，借助Cytoscape构建直接映射靶点的PPI网络，运用DIVID工具分析其GO分析和KEGG信号通路富集程度以研究其可能的分子机制。结果：通过TCMSP数据库检索到麻黄附子细辛汤相应化合成分362个，根据OB值和DL值筛选出入血活性成分35个，并预测潜在的作用靶点126个;采用R语言分析GEO数据库中编号为GSE55457的基因芯片筛选出明显的差异基因198个，检索DisGeNET数据库获得符合综合评分分值≥0.3的已知的疾病基因175个;借助GeneMANIA构建PPI网络表明关键靶点之间是相互作用;利用DAVID工具进行GO分析和通路富集分析显示，麻黄附子细辛汤干预类风湿关节炎的可能作用机制是复杂多样的，与白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子、转录因子AP-1、血管内皮生长因子、γ干扰素及IL-1β等6个靶点关系密切。结论：麻黄附子细辛汤干预类风湿关节炎具有多成分、多靶点的特点，是一种多通路、多层次、多因素相关联的最终结果。
　　【关键词】 关节炎，类风湿;麻黄附子细辛汤;网络药理学;生物信息学;分子机制
　　【ABSTRACT】Objective：To explore the potential mechanism of Mahuang Fuzi Xixin Tang（麻黄附子细辛汤）in the treatment of rheumatoid arthritis based on network pharmacology and bioinformatics.Methods：TCMSP was used to screen the active components entering blood and predict the potential targets of each Chinese medicine.Based on the databases GEO and DisGENET，RA-related targets were retrieved.Cytoscape was used to build PPI network that directly maps targets，and DIVID was used to analyze its go analysis and KEGG signal path enrichment degree to study its possible molecular mechanism.Results：Three hundred and sixty-two components of Mahuang Fuzi Xixin Tang were retrieved with the database TCMSP，35 active components entering the blood were screened according to OB and DL values，and 126 potential targets were predicted.Through R language analysis，198 distinct genes were screened out from gene chip GSE55457 in GEO database and175 known disease genes with comprehensive score over 0.3 were obtained from the database DisGeNET.PPI network constructed by GeneMANIA showed that the key targets interacted with each other.Go analysis and pathway enrichment analysis by DAVID showed that the possible mechanism of Mahuang Fuzi Xixin Tang for intervention of rheumatoid arthritis was complex and diverse，and closely related with the followingsix targets：IL-6，TNF，JUN，vascular endothelial growth factor，gamma interferon and IL-1β.Conclusion：The intervention of Mahuang Fuzi Xixin Tang has the characteristics of multi-component and multi-target，which is the final result of multi-channel，multi-level and multi factor correlation.
　　【Keywords】arthritis，rheumatoid;Mahuang Fuzi Xixin Tang（麻黄附子细辛汤）;network pharmacology;bioinformatics;molecular mechanism
　　类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是最常见的自身免疫性疾病之一[1]，是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病，好发于女性[2]。临床主要表现为关节肿胀、疼痛、畸形及功能活动受限[3]。随着RA疾病的进程，晚期往往不得不行手术治疗，增加了患者的家庭负担和社会压力，严重影响正常的生活[4]。因此，深入探讨RA可能的发病机制，早期及时有效地给予对症治疗及靶向治疗，对于延缓病情进展、改善生活质量具有重要意义。 　　目前关于RA的非手术治疗方式繁多[5]，主要包括药物疗法、合理饮食和功能康复等，西药主要有非甾体抗炎药、改善病情抗风湿病药、生物制剂等，但上述药物或靶向性不强，或存在不良反应，不同程度上限制了临床用药。传统中医药凭借其整体观念原则并结合证候分期，标本兼治、无创且不良反应小，备受临床医师及患者的青睐，尤其是中成药，如风湿寒痛片、益肾蠲痹丸、麝香丸及通滞苏润江胶囊等。麻黄附子细辛汤出自《注解伤寒论》，临床研究表明，其治疗RA疗效显著[6-8]，但麻黄附子细辛汤的药效物质基础和分子机制至今尚不明确。故本研究基于网络药理学和生物信息学预测麻黄附子细辛汤治疗RA的作用靶点，探讨其可能的作用机制。
　　1 方 法
　　1.1 麻黄附子细辛汤中活性成分的筛选和靶点预测 通过中药系统药理学数据库和分析平台[9]（TCMSP）检索麻黄附子细辛汤各味中药的化学成分，借助毒药物动力学（ADME）参数进行活性成分筛选，参照平台推荐条件设定：OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18;并利用TCMSP靶点预测模型预测所获得活性成分可能的作用靶点。
　　利用网络可视化软件Cytoscape[10]（版本3.6.1）构建麻黄附子细辛汤“活性成分-靶点网络图”;利用network analyzer分析成分与靶点之间网络特征，以明确其相互作用关系。
　　1.2 RA相关靶点的挖掘 以“Rheumatoid Arthritis”为关键词检索DisGeNET数据库[11]中相关疾病作用靶点，其中纳入条件为：综合评分分值≥0.3;同时，检索Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中相关数据集，确定GEO数据库中编号为GSE55457數据集[12]，该芯片数据的原始文件包含了10个正常滑膜组织和13个RA滑膜组织样本。利用生物信息学之RMA（robust multiarray average）算法背景校正和矩阵数据归一化处理其原始文件，利用limma包二次分析芯片数据结合P值和差异倍数（FC）进行相关数值的筛选，其中显著差异基因的筛选条件为P < 0.05，FC > 2。
　　1.3 PPI网络的构建 GeneMANIA是一个灵活的、用户友好的网络界面，用于生成关于基因功能的假设、分析基因列表并为功能测试确定基因优先级[13]。通过直接映射获得麻黄附子细辛汤干预RA的关键靶点，采用GeneMANIA构建分析麻黄附子细辛汤干预RA的关键靶点的蛋白质-蛋白质相互作用关系（PPI）网络。
　　1.4 基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析 利用注释、可视化和集成发现生物信息学工具[14]（DAVID）（6.8版本）对关键靶点的GO和KEGG通路富集分析，根据重要程度借助R语言ggplot2包绘制富集分析气泡图。
　　2 结 果
　　2.1 中药的主要成分及作用靶点 检索TCMSP数据库中麻黄附子细辛汤各味中药，获得362个相关化学成分，根据前期设定的OB和DL参数标准，筛选出35个潜在入血的活性成分，见图1。利用TCMSP靶点预测模型对所得的活性成分进行预测，排除重复靶点共计126个，借助Cytoscape构建3种药材的成分-靶标网络图。结果表明，麻黄中有6种主要成分预测出98个作用靶点，附子中有8种主要成分预测出32个作用靶点，细辛中有8种主要成分预测出87个作用靶点，分析可知，草质素、氯化花翠素、槲皮素、白西尼多及白天竺葵苷元等潜在的活性成分与网络中的多个作用靶点相互关联，而肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、血管内皮生长因子（VEGFA）、转录因子AP-1（JUN）等靶点也同时作用于多个活性成分。“活性成分-靶点网络”结果显示，麻黄附子细辛汤的活性成分相互之间存在协同作用，而协同调节的作用靶点在RA的进展中发挥重要的作用。见图2。
　　2.2 RA相关靶点的检索 通过检索DisGeNET数据库得到1832个疾病相关基因，根据数据库推荐标准，纳入综合评分分值≥0.3的175个基因认为是与RA进展密切相关的靶点。
　　利用R语言分析GEO数据库中编号为GSE55457的原始数据，发现198个明显差异表达基因，其中125个上调基因和73个下调基因，被定义为潜在的RA作用靶点。借助R语言gplots包绘制聚类图见图3，plot包绘制火山图见图4。
　　2.3 麻黄附子细辛汤治疗RA的PPI网络构建 通过直接映射麻黄附子细辛汤活性成分的作用靶点和RA的相关靶点，获得17个关键靶点。药物调控疾病的内在机制往往不是单一靶点、单一通路决定的，而是受多个靶点、多条通路共同调控。采用GeneMANIA数据库构建其PPI网络分析靶点的功能关联，以寻找靶点的直接、间接调控作用关系，在17个关键靶点及其相互作用蛋白中，52.27%具有相似的共同表达特征，14.66%具有相似的通路，12.16%具有共同的定位。其他结果，包括预测、共享的蛋白质结构域及物理相互作用见图5。
　　2.4 麻黄附子细辛汤治疗RA的机制分析 为了分析上述关键靶点的的生物学分类，利用DAVID进行GO功能和Pathway通路富集分析。GO分析结果表明，关键靶点的生物过程在一氧化氮生物合成过程的正向调节、平滑肌细胞增殖的正向调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调节、钙二醇1-单加氧酶活性的正向及蛋白磷酸化的正向调节等过程中明显富集，见图6（1）;细胞成分的变化主要集中在细胞外间隙、细胞外区、分泌颗粒、脂筏及质膜外侧面等，见图6（2）;分子功能的变化主要表现在细胞因子活性、过氧化物酶活性、前列腺素内切酶活性、血红素结合、蛋白质杂化活性及生长因子活性等，见图6（3）。KEGG通路分析表明，关键靶点主要在RA、炎症性肠病、利什曼病、移植物抗宿主病、非洲锥虫病、恰加斯病及TNF信号通路中富集，见图6（4）。 　　如图6所示，麻黄附子细辛汤干预RA关键靶点主要富集在RA信号通路，P值最显著;其中17个关键靶点中IL-6、TNF、JUN、VEGFA、γ干扰素（IFNG）及IL-1β等6个靶点明显富集，见图7。
　　3 讨 论
　　RA属中医学“痹证”范畴。痹证的发生是由于腠理空疏，营卫不固，风寒湿邪乘虚侵袭所致。痹证首见于《黄帝内经》，《素问·痹论篇》记载：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹也。”因人体质不同，风寒湿邪气的偏胜，又将痹证分为行痹、痛痹、着痹、热痹等;虽然痹证分类较繁杂，但其病理机制大体相同，可归结为外感、内伤导致络脉闭阻、气血不畅。现代医学研究表明，滑膜中单核细胞、巨噬细胞、破骨细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、内皮细胞和滑膜成纤维细胞等各种活化或半转化的细胞分泌促炎细胞因子和组织降解蛋白酶将导致RA的发生及进展[15]。
　　中医药疗法作为一种“简便廉效”的综合治疗手段，在治疗RA方面的优势正不断被挖掘与研究。实验研究证实，中药单体及复方能抑制炎性介质及细胞因子的产生、改善血液动力学及抑制氧自由基损伤，进而有效地调节软骨细胞的功能、保护软骨细胞的结构以发挥治疗RA的作用[16-17]。麻黄附子细辛汤中附子回阳助阳、散寒止痛，《本草汇言》曰：“附子，回阳气，散阴寒，逐冷痰，通关节之猛药也。”细辛祛风、散寒、止痛，《本草纲目》载：“百节拘挛，风湿痹痛。”麻黄发汗解表、宣肺利水。三药合用，共奏助阳解表、温经止痛之功。任明彪等[6-7，18-19]临床研究显示，麻黄附子细辛汤治疗RA疗效显著。
　　基于网络药理学和生物信息学通过筛选麻黄附子细辛汤的潜在活性成分和作用靶点，并挖掘RA相关的已知和潜在的疾病靶点，构建直接映射的关键靶点的PPI网络，进而阐明麻黄附子细辛汤干预RA的直接和間接调控靶点和可能的作用机制。如图5所示，JUN、TNF、VEGFA、MMP-2等被广泛证实参与RA的生理过程。GO分析和KEGG通路富集分析结果显示，IL-6、TNF、JUN、VEGFA、IFNG及IL-1β等6个关键靶点主要在RA信号通路中富集。在目前的研究中，这些已知的途径已被确认为具有高度敏感性和有效性。如黄蓓等[20-21]通过分析TNF-α及其信号通路和CD4+T细胞各亚群功能的关系，指出TNF-α作为一种重要的促炎细胞因子在RA发病和进展过程中发挥着重要作用。任茜等[22]指出，MAPK信号通路作为调控组织细胞内基因的表达、生长、分化、发育、凋亡及新陈代谢等重要的信号通路，通过激活下游炎症因子介导RA慢性炎症而参与其发病机制。上述结果显示，麻黄附子细辛汤干预RA的主要作用机制与多靶点、多通路均交互存在，是诸多因素干预的综合效应，与中医药整体观念治疗疾病的特点恰恰相吻合，也为麻黄附子细辛汤干预RA多靶点、多方面的可行性和优势提供了有利证据。
　　综上所述，中药是一个多成分、多靶点、多层次的复杂体系，基于网络药理学和生物信息学不仅能阐明麻黄附子细辛汤干预RA的潜在分子机制，为后续进一步实验探讨和设计优化等提供了数据支持，而且在整体水平和分子水平上为中药新药的研发和药物与疾病的相关机制的研究提供了切实可行的理论和方法。
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　　收稿日期：2019-10-15;修回日期：2020-02-18
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