真菌分离及其抑菌性鉴定
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作者: 唐先才
摘要：本实验需重点研究的关键问题是怎样从几块不同的油菜地中取来土壤样品,然后把制作良好的培养基进行真菌分离纯化,运用形态学,理化方法鉴定出抑菌性真菌。
关键词：菌核；真菌；抑菌性；实验
中图分类号：S6 文献标识码：A文章编号：1672-3198（2011）05-0289-01
油菜菌核病又称菌核软腐病,俗称白杆、空杆、麻杆、烂杆、霉蔸等,是由油菜菌核病菌引起的一种真菌性病害。防治主要采用农业防治、化学防治等综合防治的方法,虽然对生物防治的研究报道较多,但大部分研究结果仍然停留在实验室阶段,对于利用生防细菌防治的研究主要为筛选试验,对其防病机理缺乏深入研究。本实验取样于不同油菜地的土壤进行病原物的分离与鉴定,弄清楚油菜地常见的几种真菌及其抑菌性,对于防治油菜相关病害很有意义。
1 实验内容
采集油菜地的土壤进行真菌分离纯化,通过实验结果分析对比它们之间的真菌种类有什么大同小异,分离出的真菌对油菜的生长有什么样的影响,有没有使油菜致病。
1.1 实验过程
（1）样本采集：采用五点采样法分别采集刚收获过后的菜地和表层1～35 cm深度范围内的土壤样品,充分混匀后取定量土壤样品制备土壤悬浮液。
（2）土壤悬浮液的制备：称取10g土壤置于盛有90mL无菌水的250 mL灭菌三角瓶内,充分振荡10min,制成10-1的稀释液,然后进行10倍倍比稀释至10-3。
（3）土壤真菌的分离：
①制备加有氯霉素和孟加拉红的马丁琼脂培养基。
②用稀释平板法,此种方法在土壤真菌分离中最常用,用无菌水将土壤稀释后得到的悬浮液,将一定量稀释悬浮液均匀涂抹于培养基上,菌落长成后,将单个菌落挑出。
③培养：将接种土壤浮液的平板倒置于28°的温度区培养3-5天。
④挑菌纯化：从长有单菌落的平板中选取菌落转接斜面。
（4）真菌鉴定：真菌培养基采用马铃薯葡萄糖培养基。
①制备平板：将15-20毫升溶化后冷却到50度左右的培养基倒入培养皿中。
②接种：在培养基表面划线接种。
③倒置平板：于最适温度下培养1-2天。
④观察菌落的形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度及培养基的颜色等。
1.2 需重点研究的关键问题及解决思路
设4个处理：（1）土壤未灭菌与菌核表面消毒；（2）土壤未灭菌与菌核表面未消毒；①土壤灭菌与菌核表面未消毒；②土壤灭菌与菌核表面消毒。
孟加拉红琼脂培养基对于计数来说最常用,松膏培养基可兼顾计数、分离和鉴定,适用于大多数土壤真菌和植物病原真菌的分离,尤其适宜于木生真菌的分离,并且孢子与菌落同步形成,菌落不扩展,可获得较好的测数结果,是一种用途广泛的培养基。土壤真菌中,无性态真菌（半知菌）占很大比重。无性态真菌中又以丝孢纲真菌所占份额最大。由于基本上无法通过生殖隔离试验来测定无性态真菌成员之间的亲缘关系,在培养过程中,观察真菌的形态特征和性状,如菌落的颜色、分生孢子的形态和菌丝的颜色等。查看文献从中学习,思考每次的方案。
1.3 实验主要设备、仪器及药品
（1）设备、仪器。
天平,烧杯,电炉,试管,三角瓶,棉花,橡皮圈,标签纸,量筒,灭菌吸管,玻璃棒,镊子,漏斗,分装漏斗架,显微镜,玻片等。
（2）药品。
葡萄糖,蛋白胨,1/3000孟加拉红水溶液,链霉素,琼脂,KH2PO4,MgSO4.7H2O,等。
2 结果与分析
从未灭菌土壤与表面消毒菌核、未灭菌土壤与表面未消毒菌核这两个处理中从油菜菌核表面分别分离到4株和3株不同种类的真菌；其它两处理未能诱捕到任何真菌,表明以上真菌来自土壤而非菌核。7株菌株纯化后回接到表面消毒的菌核上。20d时从土壤中取出菌核,少数菌核破碎,大多数菌核变软,表面长有大量孢子,显示已经被分解。经鉴定,这三个菌株分别属于短帚霉、哈茨木霉菌和棘孢曲霉。
3 小结与讨论
本试验研究表明,短帚霉、哈茨木霉菌、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）Asp－1对油菜菌核萌发有较强的抑制作用,致死率均在78%以上。木霉菌作为生防菌已有很多的报道,木霉菌生防作用的生化机制主要包括:代谢几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等多种胞外酶,强烈水解植物病原真菌的细胞壁,抑制病原菌生长与繁殖。但曲霉作为生防菌尚未见报道。将三述的三种真菌用于制作生防制剂,有助于肥田,提高土壤的活性,对保护农业环境和提高食品安全很有效果,生物防治前景广阔。
参考文献
［1］陈天寿.微生物培养基的制造与应用［M］.北京:中国农业出版社,1995.
［2］中国科学院南京土壤研究所微生物室.土壤微生物研究法 ［M］.北京:科学出版社,1985.
［3］周德庆.微生物学教程［M］.北京：高等教育出版社,2007.
［4］赵斌,何绍江.微生物学实验［M］.北京：科学出版社,2006.
［5］陈天寿.微生物培养基的制造与应用［M］.北京：中国农业出版社,1995.
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