革兰染色涂片检查及结果影响因素浅析
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【摘 要】尽管临床微生物实验室因新技术的不断出现而发生巨大变化，但作为传统技术的革兰染色仍然具有相当重要的作用。它可先于培养结果，迅速地为临床医生提供潜在病原菌信息，进而为经验性治疗方案指出方向。本文将重点介绍革兰染色涂片检查的工作原理和方法，并简单论述影响革兰染色结果的相关因素，以提高广大群众的认知，积极配合临床检验工作，也有助于提高实验结果的准确性。
【关键词】革兰染色;涂片检查;操作步骤;影响因素
【中图分类号】R446.5 【文献标识码】B 【文章编号】1672-3783（2019）08-03--01
1 案例介绍
某患者，男，34岁，因排尿刺痛和排尿困难2天，到我院泌尿外科就诊。检查见：尿道口红肿并伴有黏稠脓性分泌物，取脓性分泌物涂片后送检验科微生物室检查。革兰染色后，镜下见大量白细胞及革兰阴性双球菌，可见细胞内吞噬形态，报告为“涂片查见革兰阴性双球菌（细胞内）”，同时尿常规结果显示白细胞（WBC）阳性，尿沉渣结果显示WBC 78.6 /μL（正常参考值0～26）。临床考虑为急性淋菌性尿道炎，进行对症治疗，输液消炎。
用药治疗5d后症状显著缓解，又到本市另一家三甲医院进行尿道分泌物革兰染色涂片检查，结果为 “涂片未查见革兰阴性双球菌”。患者对此表示不理解，用药治疗后症状虽有缓解，但其仍存有一定的不适症状，为何革兰染色涂片检查未见有革兰阴性双球菌。检验人员耐心解释，淋病奈瑟菌感染后起始症状为急性尿道炎，经有效药物治疗后可使病原菌减少或消失，从而病情得到控制。但机体处于恢复期，病原体即使杀灭后也会因为代谢产物反应而出现某些不适症状，需继续进行巩固治疗。革兰染色涂片检查显示阴性表示病情已有好转，治疗有效。
究竟什么是革兰染色涂片检查呢？下文将逐一论述。
2 革兰染色涂片检查概述
2.1 革兰染色的工作原理
革兰染色法是1884年由丹麦医师Gram创立，直到現今，其仍是细菌学检验中广泛应用的一种鉴别染色法。该方法主要用于细菌分类与鉴定，通过初染、媒染、脱色复染步骤使细菌与背景形成较为鲜明的对比，这就有助于清楚地观察到细菌的结构、排列方式、形态特征等，还可以根据菌体着色情况的不同将细菌分为革兰阳性菌（菌体呈紫色）和革兰阴性菌（菌体呈红色）两种，故其在初步识别细菌，缩小诊断范围方面具有不可替代的作用[1]。其次，该方法也可为药物选择提供参考依据，这是因为革兰阴性菌、革兰阳性菌的细胞壁结构差异较大，其治疗所用的抗生素也不尽相同，故进行革兰染色检查有助于临床治疗用药。
2.2 革兰染色检验步骤
（1）涂片：用接种环蘸取少量无菌生理盐水到洁净的玻片上，随后用接种环取少量经细菌培养的菌落与生理盐水混匀制作成涂片。
（2）干燥：在室温下将涂片进行干燥处理。
（3）固定：标本面朝上，手持玻片的一侧在酒精灯的火焰外侧来回移动3～4次，玻片的温度以手背皮肤触及玻片背面不烫手为宜，随后在室温中放置冷却。
（4）染色（快速革兰染色法Baso试剂）：①初染：将检测的涂片固定后，在涂片的菌膜上滴加适量的龙胆紫染液，染色10s，水洗，甩干;②媒染：在涂片菌膜表面滴加适量的碘液，染色10s，水洗，甩干;③脱色：滴加数滴脱色液，轻轻摇动涂片以进行脱色，10s后水洗，甩干;④复染：加沙黄染色液复染10s，水洗;⑤在空气中晾干进行镜检。
3 影响革兰染色结果的相关因素
3.1 细菌因素
抗菌药物影响：细菌培养所用标本应在使用抗菌药物之前采集，若细菌已受抗菌药物作用，则其形态大小排列及染色性均可发生改变。
（2）菌龄因素：细菌在生长繁殖过程中，只有在生长旺盛且各种生物特征均稳定阶段的细菌能够真实反映细菌的生化反应及染色性情况。若细菌培养时间过长，菌龄过大，则细胞衰老，各种生命特征趋于衰败，势必影响涂片染色结果各项相关检查准确性[2]。
3.2 涂片质量因素
（1）涂片厚度：当涂片太厚时细菌无法分开，在脱色时由于涂片太厚导致第一步染上的龙胆紫颜色无法完全脱去，这就会使染色结果出现着色不均的情况，革兰阴性菌可能出现紫色，从而影响结果判断。
（2）干燥固定：涂片的固定不仅杀死细菌，改变其细胞壁的渗透性，还可让细菌黏附在载玻片上，使其维持原有的形态。准确的涂片固定方法是把干燥的涂有细菌的载玻片以合适的温度进行烘烤。若在干燥或固定过程中载玻片干燥温度过高或火烤时
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间过长，则会影响细菌的渗透性，导致菌体染色结果出现异常。
（3）脱色时间掌握不当：一般情况下，阴性菌的渗透性较大，易脱色;而阳性菌的渗透性较低，不易被脱色。然而，在两种菌体固定时间相同的条件下，若脱色时间过短会出现革兰阴性菌染上龙胆紫溶液后未能完全脱色，而误判为阳性菌;若脱色时间过长，会让一些革兰阳性菌脱色过度，呈现阴性菌的着色特征，影响结果判定。因此，在实际脱色操作中需根据涂片的厚度灵活掌握脱色时间，快速革兰染色一般为10s，可根据室温及涂片厚度情况灵活掌握。
3.3 染液因素
（1）初染的龙胆紫溶液使用不对：若使用的龙胆紫溶液浓度过高，会使其不容易脱色，这就有可能使阴性菌被误认为是阳性菌。
（2）媒染的碘液放置时间过长：选择碘液作为媒染剂是因为其能够提高染液与细菌的亲和力。但在染色过程中使用了放置时间较长的碘液进行媒染，会影响其媒染作用，导致染剂与细菌的结合不牢固，易脱色，造成阳性菌误认为阴性菌。
（3）脱色使用的脱色液浓度不当：脱色液浓度不同则脱色效果不同，以常用的Baso快速革兰染液来说，厚薄适宜的涂片滴加脱色液后轻轻摇动玻片至无紫色脱出即可，时间大约几秒到10s.若脱色液浓度偏低则应适当延长脱色时间。
3.4 温度对染色的影响
一般来说，室温升高则革兰氏染色各步操作均可适当缩短时间，而室温低于正常时则应适当延长各步时间，若缺乏经验，可增加质控片作为染色参考来控制染色效果。
4 总结
革兰氏染色是微生物检测过程中常用到的基本技能之一，也是辅助临床鉴别细菌种类的基础方法之一。由于细菌的结构存有差异，故通过染色可形成不同的染色效果，因此充分了解染色性能以及染色结果的影响因素，提高检测准确性，有助于细菌的鉴别诊断以及临床用药。
参考文献
宁丹.浅析微生物标本培养前涂片革兰染色镜检的临床研究意义[J].临床检验杂志，2018，7（1）58-60.
王芳，宋瑛琳，田明.革兰氏染色结果的影响因素及原因分析[J].实验室科学，2009，6（1）：104-106.
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