基于PD-L1阻断的联合免疫治疗在结直肠癌中的应用

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　　 【摘要】 结直肠癌肿瘤作为临床常见的恶性肿瘤疾病之一，针对其免疫治疗机制、逃逸机制以及程序性细胞凋亡蛋白及其配体（PD-L1）的临床研究一直是医学界孜孜不倦探究的热点课题。在本文中，笔者综述基于PD-L1阻断的联合免疫治疗结直肠癌的相关试验结果，旨在为后续的临床研究提供参考。
　　 【关键词】 免疫治疗; 结直肠癌; 程序性细胞凋亡蛋白配体
　　 Application of Combined Immunotherapy Based on PD-L1 Block in Colorectal Cancer/CHEN Yilin.//Medical Innovation of China，2019，16（26）：-172
　　 【Abstract】 As one of the common malignant tumors in clinic， the clinical research on immunotherapy mechanism，escape mechanism and programmed apoptotic protein and its ligand（PD-L1） of colorectal cancer has been a hot topic for medical scholars.In this article，we review the results of combined immunotherapy for colorectal cancer based on PD-L1 blockade，in order to provide reference for follow-up clinical research.
　　 【Key words】 Immunotherapy; Colorectal cancer; Programmed apoptotic protein ligand
　　 First-author’s address： The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China
　　 doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.26.044
　　 结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三位常見的恶性肿瘤。早期结直肠癌通过以手术为主的综合治疗可得到治愈，但有30%～40%患者初诊时即发现局部进展或者合并转移，无法通过手术治愈，预后较差。合并肝转移、肺转移的患者5年生存率分别为50%和43.7%。而腹膜转移患者，3年生存率也仅有18%，同期发现的腹膜转移预期寿命不到9个月[1]。
　　 随着对肿瘤微环境认识的不断加深，也已出现多种免疫治疗方法，阻滞检查点分子，激活抗肿瘤免疫的途径被认为是最有效的手段之一。其中又以PD-1/PD-L1途径最受关注。最新（2017）版NCCN指南中首次将免疫检查点抑制剂PD-1单抗Pembrolizumab和Nivolumab推荐用于具有错配修复缺失/微卫星不稳定（dMMR/MSI-H）分子表型的mCRC的末线治疗。微卫星不稳定型（microsatellite instability，MSI）状态是PD通路阻滞剂重要的疗效预测指标。遗憾的是，dMMR在结直肠癌的发生率随分期逐步下降，Ⅱ期15%～20%，Ⅲ期5%～10%，IV期<5%[2]。在临床试验中，即使患者呈MSI-H状态，其客观反应率也仅有40%，意味着仍有半数以上患者对治疗无反应。对于微卫星稳定型（MSS）患者和无反应的MSI型患者，迫切需要挖掘更有效的治疗手段。
　　 目前认为，肿瘤免疫治疗效果与免疫细胞大量浸润相关，这类型的免疫浸润，以辅助性T细胞（Th细胞）浸润和主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类相关基因表达为特征。这类相关基因表达产物包含免疫抑制性的细胞因子和检查点分子，Losa等[3]认为，免疫微环境诱导检查点分子的代偿性增加，包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、LAG-3等分子，这些分子保护肿瘤细胞免于凋亡。根据这些证据，有理由设想，PD通路阻滞联合其他治疗措施创造免疫细胞浸润环境，并联合IDO、LAG-3、CTLA-4等其他检查点靶向药物，有可能改善结直肠癌的疗效并扩大适应证人群。
　　1 PD-1/PD-L1通路作用机制
　　 PD-1（CD279）是一种共抑制性受体，在CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞、B细胞和单核/巨噬细胞上可以被诱导表达。已知的PD-1配体包括PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）。T细胞分泌的IFN-γ可以诱导肿瘤细胞表达PD-L1，也有多种免疫细胞和非免疫细胞天然表达PD-L1，PD-L2的表达则完全依赖于微环境的刺激诱导[4]。PD-L1阳性的细胞，尤其是抗原提呈细胞（APCs）和肿瘤细胞，与PD-1阳性的T细胞结合，引起T细胞功能失调，主要表现为增殖减弱、细胞因子产生减少、细胞毒功能降低。但文献[4]研究认为，结直肠肿瘤即使受到T细胞分泌的IFN-γ诱导，细胞膜表面表达的PD-L1也不多。而T细胞浸润伴随着大量PD-L1阳性髓源性细胞群，T细胞的抗肿瘤作用可能是受这些髓源性细胞的抑制。
　　 有几种模式可以用来解释PD-1/PD-L1通路介导的T细胞免疫逃逸机制：（1）PD-L1和PD-1结合导致T细胞凋亡、无反应、衰竭，并表达白介素10（IL-10）。PD-L1的作用犹如分子“屏障”，保护PD-L1+的肿瘤细胞免受CD8+T细胞诱发的溶解作用[5]。（2）PD-L1还可以和CD80相互作用。活化的T细胞和APCs会表达CD80，CD80作为受体和PD-L1结合后传递抑制性信号，这已在小鼠模型上获得证实。（3）PD-L1可以作为受体“反向”传递信号至T细胞和肿瘤细胞，进而影响其存活[6]。但是这种反向信号的细胞内生化机制尚不清楚。可见，PD-L1能够分别作为配体和受体介导免疫调理功能。基于以上原理，阻断PD-1/PD-L1相互结合可作为结直肠癌的治疗策略。 　　 除了PD-1能与PD-L2结合，另一种配体RGMb也能与其结合。可见阻断PD通路有不同的生物学机制。不同阻滞剂改变其配体与受体的动态平衡，引起不一样的生物学效应。这些受体和配体在细胞内的表达谱、表达调控、潜在相互作用、与人体抗肿瘤免疫及检查点免疫治疗的关系，都尚未完全清楚。而且，由于PD-L1被多种细胞表达，并通过不同的机制诱导免疫调理，因而目前仍不清楚哪种细胞和分子机制与该通路阻滞剂的疗效相关。
　　 尽管如此，在临床研究中发现，阻断PD-1/PD-L1通路治疗有效的患者具有一些相似的细胞和分子模式。在结直肠癌患者中，微卫星不稳定型（microsatellite instability，MSI）患者具有较高的临床反应率，一项小型二期临床试验中，1例MSI-H患者接受抗PD-1治疗后获得临床完全缓解（complete response，CR），随访3年无复发[7]。在另一项试验中，dMMR肠癌患者接受PD-1阻滞剂治疗获得40%的客观反应率和78%的无进展生存率[8]。可见MSI结直肠癌患者的免疫表型利于PD通路阻滞剂发挥作用。
　　2 相关生物标志
　　 个体免疫表型的主要决定因素还不明确，尚无研究能够系统阐述体细胞系或胚胎细胞系内驱动免疫反应的分子机制。但识别与肿瘤微环境相关的生物标志仍然十分关键，因为它有助于免疫治疗措施的合理选择。
　　2.1 MSI 是目前比较公认的能够预测结直肠癌免疫治疗有效性的生物标志。Lal等[9]研究表明，MSI-H肿瘤免疫细胞大量浸润，伴随Th细胞浸润和MHC Ⅱ类相关基因表达。这些表达产物包含各种细胞因子和免疫抑制性的检查点分子。MSI类型肠癌是一个经典的肿瘤适应性抵抗的例子，肿瘤微环境中以Th1和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）为主，诱导PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、LAG-3等多种检查点分子代偿性增加，这些分子保护肿瘤细胞免于受到主动免疫攻击。根据这些结果，MSI型肿瘤在PD-1/PD-L1通路阻滞治疗中可能获益，联合IDO、LAG-3、CTLA-4等其他检查点抑制剂的治疗也有理论支持。
　　2.2 KRAS 与MSI相反，RAS突变预示着免疫浸润相对较弱，抑制性分子表达较少。KRAS和NRAS突变的结直肠癌组织里，CD4+T细胞水平明显减少。这种免疫相对静止的状态不利于免疫治疗。Ras突变患者，检查点阻滞剂治疗有效性降低，针对这部分患者需要新的治疗策略。此外，Kocian等[10]观察到，密码子13突变的肿瘤具有明显的高增殖率，并且无论突变类型，肿瘤浸润淋巴细胞的模式具有更多变化性，这类患者表现出低水平的TILs和高水平的CD1a+/CD-LAMP+腫瘤浸润树突状细胞（DC）比率，与更高的肿瘤特异死亡率相关。由于量化肿瘤内的免疫反应水平对结直肠癌预后有强烈的预测作用，将患者的基因特征和免疫细胞特点相结合可为识别高危患者提供依据。
　　2.3 BRAF 结直肠癌中BRAF突变占5%～15%，并且通常在MSI-H肿瘤中发现。尽管在MSS肿瘤中，BRAF突变通常预后不佳，但在MSI-H肿瘤中的作用仍有争议。有学者假设，BRAF突变本身并不影响预后，其影响是取决于产生BRAF突变的不同遗传途径的类型[11]。目前没有证据说明BRAF突变对结直肠癌免疫环境产生影响。然而最近研究表明，携带BRAF突变的黑色素瘤也可能具有变化的免疫应答，提示这部分患者可能存在其他的治疗途径[12]。恶性黑色素瘤的BRAF靶向治疗已经取得了很大进展。有理由假设，对于BRAF突变的结直肠癌患者，BRAF抑制剂联合PD通路阻滞剂可能改善疗效。
　　2.4 PD-L1 肿瘤细胞和APCs（抗原提呈细胞）表达高水平PD-L1，肿瘤相关PD-L1+DCs导致T细胞功能抑制。多种癌组织中的PD-L1表达提示不良预后。在恶性黑色素瘤、NSCLC和RCC中，已观察到肿瘤组织表达PD-L1与抗PD治疗反应的相关性。除了肿瘤细胞上表达PD-L1，肿瘤浸润淋巴细胞上，尤其是骨髓来源APCs（巨噬细胞和髓源性DCs）上表达PD-L1，与抗PD-L1治疗反应具有相关性。相反的，多数进展病例中无论肿瘤细胞或者肿瘤浸润淋巴细胞都未出现PD-L1上调。在结直肠癌中，有研究却发现PD-L1的表达与pMMR亚组的预后呈正相关[13]。因此有学者指出，治疗前肿瘤细胞和免疫细胞表面的PD-L1表达情况，对预测PD通路阻滞剂的治疗反应是有用的，但并非绝对[14]。
　　2.5 肿瘤新抗原/体细胞突变负荷 肿瘤相关抗原（TAAs）大部分是自身抗原，但其包含的体细胞基因突变，可能是肿瘤特异性的。这些突变相关抗原能够成为肿瘤特异抗原，被呈递给T细胞识别。结直肠癌MSI亚组比MSS亚组具有多达8倍的体细胞突变负荷。早期临床实验的结果发现肺癌和黑色素瘤对PD通路抑制治疗有效。这两类肿瘤因为暴露于烟草和紫外线，具有较高的体细胞突变数。这提示高突变抗原负荷可能与更好的PD通路阻滞剂疗效相关。
　　3 肿瘤微环境分类
　　 以上几种生物标志物均是在基因水平对治疗进行预测，其预测价值尚无定论。根据免疫特点，肿瘤可以分成“炎症”和“无炎症”类型。前者赋于Th1型免疫标志，包括Th1趋化因子和效应性T细胞，可能存在PD-L1表达增高。后者缺乏免疫浸润，所表达PD-L1有限。但淋巴细胞富集的区域未必总会表达PD-L1。因而有学者建议，以PD-L1表达和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）将肿瘤微环境分为四型：T1（PD-L1-，TIL-），T2（PD-L1+，TIL+），T3（PD-L1-，TIL+），T4（PD-L1+，TIL-）[15]。
　　 根据以上分类，T2型肿瘤对PD通路阻滞剂可能有较好的临床反应。但T1和T4型占大多数，这两类肿瘤微环境中缺少淋巴细胞浸润，即缺少“炎症”反应。即使出现PD-L1表达，也可能是因为肿瘤内源性基因激活，而不是TILs分泌的IFN-γ诱发，因此对治疗无反应。缺少炎症反应的原因有很多，从肿瘤抗原无法提呈，到免疫抑制机制的激活都有可能。在实践中，局部放疗、溶瘤病毒、冷冻等手段可以形成“炎症”环境，增加肿瘤抗原的效价。抗CTLA-4抗体也可以增强炎症浸润。另外，肿瘤疫苗和T细胞过继疗法，包括嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法也能增加TILs聚集。靶向共刺激分子也被证明可以增强肿瘤浸润。T3型肿瘤有TILs而缺少PD-L1，可能是因为效应性T细胞分泌IFN-γ的功能受损。其中的分子机制仍不明确。不过试验中已经发现利用某些共刺激分子途径能够将T3类型肿瘤逆转成T2型[16]。由此可见，联合治疗是提高疗效和扩大获益人群的必要策略。下一步的迫切任务就是开发联合治疗方案以提高不同类型肿瘤患者的临床反应。 　　4 联合治疗
　　 由于肿瘤和宿主间免疫调节机制存在巨大复杂性和异质性，联合治疗也许可以有效改善肿瘤治疗效果，主要策略现简述如下。
　　4.1 破坏肿瘤微环境中的抑制性网络 微环境中的免疫抑制网络是自发性和治疗诱导的抗肿瘤免疫反应的主要障碍。抑制性B7家族分子阻断后所获得的临床反应表明，靶向肿瘤微环境中的抑制成分可能获得明显疗效。（1）以调节性T细胞（Tregs）为靶点。在肿瘤微环境中，Tregs显著抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，以Tregs为靶点是可行的治疗策略，Tregs表达CTLA-4，抗CTLA-4抗体可以使肿瘤中的Tregs耗竭。FDA已于2011年批准完全人源抗CTLA-4抗体Ipilimumab应用于进展期黑色素瘤[17]，在结直肠癌的Tregs和预后呈负相关，因此与CTLA-4的联合方案可能有效。（2）以髓源性细胞为靶点。在肿瘤微环境中，肿瘤相关MDSCs和抑制性APCs如巨噬细胞等髓源性细胞能够抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫。鉴于吲哚胺-2，3-双加氧酶（IDO）在MDSC诱导的T细胞抑制中起到重要作用，利用IDO抑制剂联合PD阻滞剂应该是潜在的可行的治疗方案。（3）其他潜在的抑制性免疫球蛋白超家族分子。淋巴细胞活化基因3蛋白（LAG-3）也属于细胞膜表面免疫球蛋白超家族中的一员。LAG-3在活化的T细胞、NK细胞、B细胞和DCs上均有表达，通过与MHC Ⅱ类分子的结合，负性调节T细胞增殖。此外，LAG-3减弱Tregs功能。最近研究揭示，衰竭的CD8+T细胞能够表达LAG-3，并且如果与PD-1等多种异质性受体联合表达，则细胞衰竭更强烈[18]。而且同时抑制PD-1和LAG-3，比分别抑制这两个受体，效应性T细胞活性增加更显著。有研究发现结直肠癌组织中LAG-3+/CD49b+细胞的比率较癌旁组织高[19]。不难假设，联合LAG-3抑制剂在结直肠癌治疗中的价值值得进一步研究。
　　 肿瘤浸润T细胞上还表达有T细胞免疫球蛋白黏蛋白（TIM-3）和T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域（TIGIT），用抗体抑制TIM-3和TIGIT均可以增加效应性T细胞功能，因此联合这些抑制性分子有望进一步提高疗效。
　　4.2 以肿瘤特异性抗原和抗原呈递为目标 （1）新抗原疫苗。传统疫苗可以激活T细胞并诱导靶向肿瘤细胞免疫反应，但该治疗临床反应的可重复性还没有得到检验。在动物模型中，PD通路阻滞剂能够增加传统疫苗的抗肿瘤效果[20]。由于体细胞基因突变能够产生肿瘤特异性新抗原，引起新抗原特异性T细胞反应。新抗原疫苗的有效性已在动物实验中证实[21]。而肿瘤患者身上也已发现突变抗原特异性T细胞反应。因此，纳入新的特异性抗原的新型疫苗平台，有望与PD通路阻滞剂实现联合治疗。但研究的难点在于如何生产有效的个体化的新抗原疫苗，以及进一步识别共享抗原以联合免疫调节抗体。由于肿瘤微环境处于免疫抑制和代谢失调状态，除了需要通过特异性疫苗诱导和扩大新抗原特异性T细胞反应外，保证这些T细胞有进入肿瘤微环境并且在此生存也是研究的关键。（2）溶瘤病毒治疗。Talimogene laherparepvec（T-VEC）是1型单纯疱疹病毒衍生的溶瘤免疫疗法，它可以在肿瘤细胞中选择性复制，并产生粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。FDA已经批准T-VEC应用于不可切除的术后复发型黑色素瘤患者的皮肤、皮下、淋巴结病变。T-VEC可能触发DC分化，增强抗原提呈，增加T细胞激活和促进IFN-γ分泌，进而诱导PD-L1表达。因此或许可以优先考虑将T-VEC与PD通路阻滞剂组成联合治疗方案。（3）全细胞（自体肿瘤细胞）疫苗。许多研究尝试使用自体肠癌细胞诱导抗肿瘤免疫反应。近期的研究发现根治术后病理Ⅱ、Ⅲ期CRC患者接受卡介苗（BCG）佐剂联合自体肿瘤细胞治疗，与单纯手术组相比，在总体DFS、结肠癌亚组DFS和OS上都有显著提高[22]。近期一项多中心前瞻性Ⅲ期临床试验中，128例患者接受BCG联合自体照射肿瘤细胞（OncoVax）治疗，结果显示Ⅱ期患者的DFS和OS较单纯手术组均有提高，但Ⅲ期患者未见获益[23]。而BCG佐剂提高DFS的效应虽然延迟了1年才出现，但长期持续。也有研究尝试使用纽卡斯尔病毒感染的肿瘤细胞作为自体肠癌疫苗，在手术后CRC中OS获得了一定的改善[24]。一项前瞻性Ⅲ期临床试验针对肝转移CRC患者在转移灶切除术后接受自体肿瘤细胞疫苗接种，尽管在结肠癌亚组中发现OS和无转移生存率有一定提高，但在整体队列中未发现两个指标有明显改善[25]。可见虽然自体肿瘤疫苗的有效性尚存争议，但不失为联合治疗的一种选择。
　　4.3 用COX-2抑制剂靶向抑制炎症介质 前列腺素E2（PGE2）及其关键合成酶环氧合酶-2（COX-2）可以直接介导促肿瘤反应，并且在肿瘤微环境中募集和誘导骨髓来源抑制性细胞（MDSCs）。但是PD通路阻滞剂可能会增加PGE2的表达，增加促肿瘤炎性细胞因子，这会抵消治疗作用。动物研究显示COX-2抑制剂与PD通路阻滞剂有协同抗肿瘤作用[26]，提示COX抑制剂可以作为有效的免疫佐剂，在以免疫治疗为基础的抗肿瘤治疗中发挥作用。
　　4.4 以肿瘤细胞为靶点 （1）局部放疗。放射治疗可以破坏局部肿瘤，有报道认为放疗能够激活先天性免疫反应信号途径，损伤Tregs，激活CD8+T细胞，刺激趋化因子表达，还能促使免疫细胞浸润肿瘤[27]，这些作用可以减弱放射诱导的肿瘤免疫保护。放疗后PD-L1表达增高使得PD通路阻滞剂有机会发挥疗效。基于以上原因，放疗联合抗PD治疗在几种肿瘤的小鼠模型上产生了协同抗肿瘤效果。尽管有良好的证据支持放疗联合PD通路阻滞剂治疗，但放疗的剂量、部位、时间等关键参数还需要进一步研究。（2）化疗。小鼠实验显示，蒽环类和奥沙利铂化疗药物的治疗反应，部分依赖于Ⅰ型IFN信号诱导的免疫反应[28]。而IFN信号通路可以诱导PD-L1表达。在小鼠前列腺癌模型中观察到奥沙利铂可以促进PD-L1+浆细胞浸润[29]。这些研究说明PD通路阻滞剂能够增强化疗效果。因为化疗也能诱发基因突变，有理由假设与化疗药物联合的治疗方案可以诱突变特异性新抗原产生，进而诱发新抗原特异性T细胞反应并影响临床治疗结局。不过，化疗也可损害免疫系统，而PD通路阻滞剂依赖于预先存在的免疫反应尤其是在肿瘤微环境中。因此与化疗的组合需要更深入研究。 　　4.5 微生物 最近幾项研究显示，在动物模型中，肠道微生物能够影响肿瘤化疗效果，微生物移植可以增强化疗诱导的Th1和Th17反应，有助于根除肿瘤[30-31]。这与人卵巢癌中多能Th17细胞的抗肿瘤作用一致。同样地，在皮下种植肿瘤的小鼠身上，共生细菌能够改变抗PD-L1治疗效果。“好”的细菌，如双歧杆菌，在治疗中能够增强对PD-L1阻滞剂的反应。抗CTLA-4的抗肿瘤效果同样受不同拟杆菌的影响，多形似杆菌或脆弱拟杆菌诱导的特异性T细胞反应与CTLA-4阻滞剂的疗效相关。根据现有研究可以认为，肠道微生物免疫反应能够产生全身性作用影响抗肿瘤免疫和治疗。虽然患者的肠道微生物对阻断PD通路的影响仍有待确定[32]，根据以上研究可认为，益生菌或许可以作为免疫佐剂在治疗中发挥重要作用。
　　 免疫治疗治疗晚期结直肠癌重新受到重视。以PD-1/PD-L1为首的检查点分子阻滞剂在治疗中的价值逐步被认可。但由于结直肠癌的特殊生物学特点和复杂的肿瘤环境，单一的治疗手段不能获得满意的疗效。根据微环境的特点，有必要开发两种甚至多种手段联合的治疗方案。
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　　（收稿日期：2019-02-19） （本文編辑：张爽）
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