隐匿性HBV感染相关S基因突变对多种抗-HBs及HBsAg检测的影响

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　　[摘要] 目的 觀察隐匿性HBV感染（OBI）S基因突变对HBsAg检测产生的影响。 方法 挑选9种典型的S基因突变株，从1例OBI患者及3例献血人员的血清进行分离。依次使用突变及野生型S基因重组质粒传染仓鼠的卵巢系统，深入分析入选的突变株HBsAg表达及突变蛋白对抗体和所用检测试剂反应性的影响。 结果 利用HBsAg试剂对不同突变株胞内HBsAg水平进行检测，与野生株相比，其水平显著降低。同一种样品采用抗-His抗体检测结果表明，与野生株对比，只有M1、M2、M5、M6、M7的HBsAg-His融合蛋白表达显著下降。与野生株比较，不同突变株与6种抗-HBs反应性显著下降，M1、M4、M7、M9和抗体4及M9出现的HBsAg和抗体6反应性水平最差。不同突变株和6种HBsAg试剂反应性与野生株相比显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。ELISA试剂内D、E、F漏检率依次为11.2%、22.3%、55.7%。 结论 突变HBsAg和抗-HBs结合力下降成为引起OBI表现的关键原因之一，通常使用HBsAg试剂对于突变HBsAg检测能力有一定不足之处，急需进行改进提升检测水平。
　　[关键词] 隐匿性HBV感染;基因突变;HBsAg检测;乙肝病毒
　　[中图分类号] R512.62          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）02-0020-04
　　Effect of occult HBV infection related S gene mutation on detection of multiple anti-HBs and HBsAg
　　REN Lingjun   FANG Lijuan
　　Department of Clinical Laboratory， Hangzhou Dajiangdong Hospital， Hangzhou   311225， China
　　[Abstract] Objective To observe the effect of occult HBV infection （OBI） S gene mutation on HBsAg detection. Methods Nine typical S gene mutants were selected and isolated from the serum of one OBI patient and three blood donors. The ovarian system of the hamster was infected with the mutant and wild-type S gene recombinant plasmid in turn. The expression of the selected mutant HBsAg and the effect of the mutant protein on the reactivity of the antibody and the detection reagent were analyzed. Results The intracellular HBsAg level of different mutants was detected by HBsAg reagent. And the levels were significantly lower than those of wild-type strains. The test results of the same sample using anti-His antibody indicated that compared with that of the wild-type strain， only the expression of HBsAg-His fusion protein of M1， M2， M5， M6 and M7 was significantly decreased. Compared with that of the wild-type strains， the reactivity of different mutants with 6 anti-HBs was significantly decreased， and the reactivity levels of HBsAg in M1、M4、M7、M9 with antibody 4 and HBsAg in M9 with antibody 6 were the worst. The reactivity of different mutant strains with 6 HBsAg reagents was significantly lower than that of wild strains， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The missed detection rates of D， E， and F in the ELISA reagent were 11.2%， 22.3%， and 55.7%， respectively. Conclusion The research shows that the decrease of the binding strength of mutant HBsAg and anti-HBs is one of the key reasons for the performance of OBI. Reagents generally used for the mutant HBsAg have certain shortcomings in detection capability. It is urgent to improve and improve the detection level. 　　[Key words] Occult HBV infection; Gene mutation; HBsAg detection; Hepatitis B virus
　　中国作为乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染高发区，近些年，因乙肝疫苗接种能有效减少母婴传播，人群乙肝表面抗原（HBsAg）携带率显著降低，但一般群体乙肝表面抗原阳性率依然为9.09%，且HBV变异株明显增多。HBsAg作为用于评估抗HBV治疗效果及HBV感染的主要指标之一，其主要由226个氨基酸残基构成，成为刺激B细胞出现中和性抗体的主要抗原表位。隐匿性HBV感染（OBI）作为乙型肝炎病毒受到感染的特殊形式，也是临床的一大难题，直接影响HBV诊断结果，导致临床漏检、献血人员出现筛检错误情况时有发生，极有可能引起HBV传播[1]。有学者研究指出，OBI发病机制并不清楚，S基因突变与OBI存在密切的关系，以现有技术对血清HBsAg阴性患者进行检测，但血清或者肝组织HBV DNA阳性的HBV感染状态[2]。HBV S基因突变容易导致OBI的机制在于S基因突变使得HBsAg抗原性比改变，容易引起漏诊及传播的情况。本研究挑选9种具有代表性的S基因突变株，深入研究其对于多种抗-HBs及HBsAg检测试剂反应性带来的影响，以期为类似研究提供一定的指导，现报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1一般资料
　　入选标准：本次研究获得医院伦理委员会的批准;均符合《慢性乙型肝炎防治指南》相关诊断标准[3];所有入选者均知情本研究，并簽署知情同意书。排除标准：排除资料不全者。在前期研究中，挑选1例OBI和3例OBI献血者检查的HBV S基因突变（9种）为对象，均处于MHR区域，本研究中，首次提到的5种突变基因分别为：aa122-123“KSTGLCK”插入+sQ129N（M5）、sI/T126v+sG145R（M1）、aa126-127“RPCMNCT1”插入突变（M4）、aa115-116“INGTST”插入突变（M2）、aa115-116“INGTST”插入+sG145R（M3）。研究中使用前期构成的突变和野生型pcDNA3.1（-）myc-His A重组质粒，将其插入HBV S基因区，用来完成HBsAg-His标签融合蛋白表达情况。本研究采用前期已经成功构建的突变型及野生型重组质粒，将其插入HBV S基因区，用于完成HBsAg-His标签融合蛋白。
　　1.2方法
　　1.2.1 常用试剂及仪器  采用德国Qiagen公司生产的转染质粒提取试剂盒;ELISA试剂盒主要公司包含珠海丽珠、上海科华、北京万泰等公司;Abbott i2000型全自动免疫发光分析仪;仓鼠卵巢细胞悬浮表达系统等。
　　1.2.2 方法  利用ExpiCHO悬浮细胞高表达系统对细胞进行培养，选取125 mL锥形培养摇床，将其置于温度为36.5℃、CO2培养箱，速度设定为（120±5）r/min。细胞培养与转染操作均根据说明书要求严格执行，转染粒子分别是野生、突变型pcDNA3.1（-）/myc-His A-HBs重组质粒，进行转染处理后5 d收集细胞，开展后续的实验。细胞进行转染5 d后，搜集500 μL细胞，密度约是8×106/mL，离心操作后弃细胞上清，添加500 μL×PBS重悬细胞，通过超声裂解、离心操作后收集裂解上清。通过雅培Abbott i2000检测HBsAg水平，每一个样品重复测试3次。利用双抗体夹心法对抗-HBs和突变HBsAg反应性进行检测。将野生型及突变型HBsAg-His融合蛋白稀释至2.5、0.5、0.1 ng/mL三个浓度，使用Abbott i2000定量及4种国产定性试剂对HBsAg展开检测，具体方法及结果分析根据说明书要求操作。每一个样本3个复孔，实验独立操作最少3次。
　　1.3 统计学分析
　　应用SPSS20.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，多组间使用单因素或双因素方差开展分析，组间使用Dunnett t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 胞内HBsAg-His蛋白表达情况
　　胞内融合蛋白表达状况如图1所示。根据Abbott i2000定量检测结果发现，与野生株对比，9种突变HBsAg-His融合蛋白内HBsAg水平显著降低（P<0.05），以突变株M1、M9及M6下降水平最明显。同一种样品检测结果可知，M4的HBsAg-His融合蛋白水平显著比野生株高，与野生株水平相近的分别为M3、M8、M9;与野生株相比，M1、M2、M5、M6、M7表达水平显著下降。
　　2.2 突变HBsAg与不同种类抗-HBs反应情况
　　除了突变株M2、M3出现的HBsAg与抗体3之间的反应性无显著差异，所有突变株所产生HBsAg与6种抗-HBs反应性有一定程度的下降;M1、M4、M7及M9与Ab4、M9出现HBsAg与Ab6的反应性水平最差，无法被检测出来，即：S/CO<1。与野生株比较，反应性小于50%突变株中，国产Ab5与各突变HBsAg具有较强的反应性，见表1。
　　2.3试剂漏检率分析
　　与野生株比较，除M7出现的突变HBsAg和定量及定性试剂A、B，M1、M5出现突变HBsAg和试剂E反应性并无太大差异。其他突变HBsAg和6种HBsAg试剂反应性均显著降低。在浓度为0.1 ng/mL条件下，M2、M3、M8和M9突变HBsAg无法被试剂A和B检测出来。突变抗原处于2.5、0.5及0.1 ng/mL浓度下无法同时被检测出来被判定为漏检，使用ELISA试剂D漏检率是11.2%，E、F分别为22.3%、55.7%。见图2。
　　3 讨论 　　肝脏是人体调节血液、新陈代谢的中心，由于受生活环境不断恶化及患者自身不健康的生活习惯所影响，肝脏疾病的发病率在我国呈现出明显上升的发展趋势。乙型肝炎也可以称之为乙肝，是由于患者感染乙型肝炎病毒，引起乙型肝炎，这也是一种全世界性的慢性病。我国是慢性乙肝感染的高发区，近些年，乙肝患者呈现出明显上升的趋势，具有较高的病死率。乙型肝炎是临床医学中一项慢性肝脏类疾病，其中，约30%慢性乙肝患者会演变为肝硬化[4]。其主要是由乙肝病毒导致肝脏发生纤维化及肝脏细胞坏死，随着患者病情的逐渐加重，肝脏病理学上表现为假小叶形成和再生结节，逐渐演变为肝硬化，对患者的生活质量造成严重的影响。HBsAg最早由澳大利亚发现，也是最早用于诊断HBV的标志物。HBsAg清除或消失成为判定HBC治愈的重要指标。但也有少部分HBV感染患者存在HBsAg阴性的情况，在血清或肝组织内能够检测出OBI状态，其发生机制并未明确[5]。必须注意的是，某些OBI是由于HBV S基因发生突变引起的，可能的发生机制包含降低HBsAg分泌、诱导低亲和力抗体干扰等。OBI经输血、血液透析、器官移植等操作引起HBV传播，且与慢性肝病、HCV感染等因素存在密切的关系。
　　如今，临床上有10%～20%慢性肝病患者根据临床表现、常规的生化检验、血清学检查无法明确病因，肝癌、肝硬化所占比例依次为15%、20%[6-7]。某些血清HBsAg阴性个体，采用PCR技术能够检测血清及肝组织内HBV DNA阳性，被称作隐匿性HBV感染[8]。这种感染极易出现在抗-HBs或者抗-HBc阳性者，也会出现在血清HBVM均是阴性的个体。有学者研究指出，有部分HBV感染患者HBsAg阴性，在血清或肝组织内能够检测出HBV DNA，显示为OBI状态，其发生机制并未完全清晰，已有研究证实，其与宿主、病毒相互作用存在密切的关系[9-10]。必须注意的是，有些OBI是因HBV S基因存在对中和抗体的免疫逃逸突变引发的，可能发生的机制在于降低HBsAg分泌等。
　　随着检测技术不断改进及发展，那些经典突变抗原可以被主流HBsAg试剂检测出来，但部分新型突变、联合突变抗原依然发生漏检的情况，导致输血、疫苗人群遭受感染[11-12]。HBV S基因突变旨在预防接种、抗病毒治疗等条件下出现的结果。有学者研究指出，突变HBsAg极易导致抗体识别表位构象发生改变，促使突变菌株在接种乙肝疫苗的人体中复制[13-14]。有学者研究表明，通过随访抗HBC治疗发现，S基因相关疫苗突变株会随着时间不断稳定，并逐步增加，由于免疫压力出现的OBI相关突变毒株可逃逸常规乙肝疫苗有保护抗体功能，极易导致突变毒株在乙肝疫苗接种者中出现传播[15-17]。本研究中所选9种HBV S基因突变均处于MHR区，结果表明，这些突变株HBsAg水平与野生株比较，均明显下降。为了解突变株与各種抗-HBs反应性下降对其临床试剂产生的影响，本研究选取不同的试剂盒检测突变抗原，研究结果证实，新型突变M2～M4在内大量的突变株和6种HBsAg检测试剂反应性和野生株对比，显著下降。而使用ELISA试剂D、E、F检测的漏诊率依次为11.2%、22.3%、55.7%。国外也有部分研究证实，存在HBV S基因突变和HBsAg检测试剂反应性差的情况[18-20]。这也充分说明，设法改善HBsAg检测试剂尤为重要。
　　总之，HBV S基因突变和OBI发生存在一定的关系，突变HBsAg与抗-HBs结合力降低，直接对HBsAg检测试剂的检出性能产生影响。携带S基因突变的OBI极易发生漏检、输血传播等情况。因此，下一步开展研究中，拟判断上述突变株在乙肝疫苗接种群体中与疫苗诱导抗-HBa的反应性，并对其传播风险展开研究。
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　　（收稿日期：2019-08-09）
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