水飞蓟宾对宫颈癌裸鼠移植瘤抑瘤作用机制研究

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　　摘 要 目的：探讨水飞蓟宾对宫颈癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用和作用机制。方法：建立宫颈瘤裸鼠移植瘤模型，分析药物对裸鼠的抑瘤作用；用间接免疫荧光流式细胞术检测及Western blotting实验检测COX-2、VEGF、Bax和Bcl-2的表达。结果：水飞蓟宾可剂量依赖性地抑制宫颈癌裸鼠移植瘤肿瘤组织的生长。间接免疫荧光流式细胞术检测及Western blotting实验结果表明水飞蓟宾能抑制COX-2、VEGF、Bcl-2的表达、促进Bax的表达。结论：水飞蓟宾通过抑制血管生长因子和前列腺素的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长；对宫颈癌细胞的杀伤作用是诱导细胞凋亡；降低Bcl-2蛋白的表达、增加Bax蛋白的表达为其诱发宫颈癌细胞凋亡的机制之一。
　　关键词 水飞蓟宾 宫颈癌裸鼠 抑瘤作用
　　中图分类号：R285.5； R737.33 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）05-0072-04
　　Study on the mechanism of silibinin on tumor inhibition of cervical carcinoma transplanted in nude mice
　　JIA Hao*
　　（Department of Medicine， the First People’s Hospital of Shangqiu， He’nan Shangqiu 476100， China）
　　ABSTRACT Objective： To investigate the antitumor effect and mechanism of silibinin on transplanted tumor of cervical cancer in nude mice. Methods： The xenograft model of cervical tumor in nude mice was established and the antitumor effect of drugs on nude mice was analyzed. The expression levels of COX-2， VEGF， Bax and Bcl-2 were detected by indirect immunofluorescence flow cytometry and Western blotting. Results： It was verified by the determination of indirect immunofluorescence flow cytometry and Western blotting that silibinin could inhibit the growth of tumor tissue in cervical cancer nude mice in a dose-dependent manner and the expression of COX-2， VEGF and Bcl-2 cells and promote the expression of Bax cells. Conclusion： Silibinin can inhibit the growth of tumor cells by inhibiting the synthesis of angiogenic factors and prostaglandins and its killing effect on cervical cancer cells is due to induction of cell apoptosis. One of the mechanisms that induce the apoptosis of cervical cancer cells is due to the decrease of Bcl-2 protein expression and the increase of Bax protein expression.
　　KEY WORDS silibinin； naked mice of cervical cancer； tumor inhibitory effect
　　水飞蓟宾（silibinin， SB），是从水飞蓟素中提取出来的活性成分，目前作为肝保护剂在临床中广泛使用，无论是动物实验还是临床应用，均显示良好的保肝作用和极低的不良反应。目前有研究学者发现，SB具有很好的抗肿瘤作用，对各种上皮细胞来源的肿瘤均有良好的作用，如前列腺癌、结肠癌、膀胱癌等[1]。SB已进入前列腺癌的Ⅰ期临床试验[1]。不少学者报道了SB抗癌的作用机制，特别是对于宫颈癌和肝癌[2-5]，但是对于动物实验的研究还很少，本文就SB对宫颈癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用和作用机制进行研究。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 实验仪器
　　FACScan流式细胞分析仪（美国Becton Dickinson公司）；F039200酶联免疫分析仪（奥地利Tecan公司）；Genius 6K-C台式低速离心机（长沙市鑫奥仪器仪表有限公司）。
　　1.1.2 细胞和实验动物
　　人宫颈癌HeLa细胞购于American Type Culture Collection（ATCC， Manassas， VA， USA）。使用10% 胎牛血清RPMI-1640培养液培养。裸鼠购自商丘美兰生物工程有限公司，实验动物许可证号为：SYXK（豫）2017-0006。
　　1.1.3 試剂
　　SB（批号0856 9902）、紫杉醇（批号1534 200202）均购自中国药品生物制品鉴定所）；RPMI-1640培养液（美国Hyclone公司）；抗体均由北京中杉生物技术有限公司提供。 　　1.2 方法
　　1.2.1 动物分组与处理
　　裸鼠，雌性，6～8周龄，质量15～18 g，于商丘美兰生物工程有限公司SPF级动物房普通饲料喂养。40只裸鼠随机分为空白对照组、紫杉醇组、低剂量SB组、中剂量SB组、高剂量SB组共5组。然后将0.2 ml细胞悬液皮下接种到裸鼠。待肿瘤长到5 mm以上后，①空白对照组：用饮用灭菌自来水灌胃1 ml，每日1次，连续30 d；②紫杉醇组：用10 mg/kg紫杉醇灌胃1 ml，每日1次，连续30 d。
　　分别用灭菌自来水配制的0.2、1和5 mg/ml三种质量浓度SB混悬液供低、中、高三剂量组裸鼠灌胃，每日1次，连续30 d。
　　1.2.2 观察指标
　　一般情况观察：每周1次测量并记录小鼠及肿瘤组织的基本情况；每天观察裸鼠的精神状态及背部瘤组织的生长情况等。
　　肿瘤组织测量：从给药第15天起，每 3 d测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线，V （mm3）= 0.5×L×S2（最大长径为L和横径为S）。停药次日处死裸鼠，计算抑瘤率（%）=（1-治疗组平均肿瘤质量/模型组平均肿瘤质量）×100%。
　　1.2.3 间接免疫荧光流式细胞术检测COX-2和VEGF的表达
　　切取各组组织块制备细胞悬液，于1 200 r/min离心5 min，将细胞重悬浮于染色液中于室温30 min。分别加入鼠抗人COX-2、VEGF单抗各20 ml，37 ℃孵育60 min。设立阴性对照组。PBS洗涤后加FITC标记的二抗，混匀，避光室温孵育30 min，过滤后检测。
　　1.2.4 裸鼠移植瘤组织中COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax的表达水平检测
　　取冻存组织裂解。BCA测定蛋白浓度，酶联免疫分析仪测定波长为A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。制备10%分离胶、5%浓缩胶的SDS-PAGE凝胶。吸取40 mg总蛋白，进行电泳分离，将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭。β-actin作为内参，1∶800稀释作为一抗4 ℃孵育过夜。1∶4 000稀释二抗孵育1 h，然后用显影液、定影液显色，扫描图片保存。
　　1.3 统计方法
　　数据用SPSS 25.0处理（t检验），数值用均数±标准差表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 肿瘤接种阳性率
　　由病理组织学验证，40只裸鼠注射HeLa细胞株后均长出肿瘤。6～10 d肉眼观察到长出肿瘤，22～26 d肿瘤生长到直径≥5 mm。
　　2.2 药物对裸鼠的不良反应
　　各用药组和对照组相比，裸鼠在饮食量、饮水量、排便、以及活动力上均没有显著的差异。
　　2.3 对肿瘤生长的影响
　　对照组肿瘤体积增长最快；与对照组相比，各用药组肿瘤体积的增长有明显的抑制作用；SB 0.2、1和5 mg/ml连续给药30 d的荷瘤裸鼠，其抑制肿瘤生长的作用随着剂量的增加逐渐增大（图1）。
　　2.4 对肿瘤抑制率的影响
　　各用药组与对照组相比都有不同程度的抑瘤作用，SB的抑瘤作用与紫杉醇相当，且呈剂量依赖性，有统计学意义（P<0.05，表1）。
　　2.5 對宫颈癌裸鼠移植瘤组织内COX-2、VEGF的表达影响
　　紫杉醇组、中剂量SB组和高剂量SB组与对照组相比，COX-2和VEGF蛋白表达的荧光测定强度差异有统计学意义（P<0.01，图2），表明SB可抑制移植瘤中HeLa细胞COX-2和VEGF的表达。
　　2.6 对宫颈癌裸鼠移植瘤COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax的表达水平的影响
　　以β-actin为对照，Western blotting检测各组宫颈癌裸鼠移植瘤组织切片COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax的表达水平，结果显示，紫杉醇组、中剂量SB组和高剂量SB组与对照组相比，COX-2、VEGF、Bcl-2的表达水平显著降低（P<0.05，图3），且其抑制作用与药物血清浓度呈正相关；而Bax的表达显著升高（P<0.05，图3），且其抑制作用与药物血清浓度呈负相关。
　　3 讨论
　　裸鼠是一种小鼠突变株，异种移植后的人体肿瘤细胞在裸鼠体内仍保持其原有的组织形态、免疫学特点等性质。本实验在学校动物实验中心SPF级实验室进行，并严格按照实验室规范操作，实验过程中无裸鼠死亡。
　　肿瘤细胞依靠分泌血管生长因子（VEGF、bFGF等）保证其自身生长[6]。COX-2是前列腺素合成过程的限速酶，其过表达与肿瘤新生血管形成密切相关[7]。中国传统药物的抗肿瘤作用机制主要有诱导肿瘤细胞凋亡[8]、激活免疫系统间接抑制肿瘤等。凋亡主要有线粒体通路，Bcl-2蛋白家族引起线粒体膜通透性增加，引起一系列级联反应，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2蛋白家族成员，Bcl-2/Bax的比例可决定细胞的命运，其比例增高，细胞不易发生凋亡，而比例降低则会导致细胞凋亡[9]。
　　本试验研究发现，SB可剂量依赖性地抑制裸鼠移植瘤肿瘤组织的生长，可下调VEGF、COX-2的表达，表明SB通过抑制血管生长因子和前列腺素的合成，从而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。本试验还发现SB可上调Bax的表达，下调Bcl-2的表达，Bcl-2/Bax的比例降低，从而激活线粒体信号转导途径，促进肿瘤细胞的凋亡。 　　我们将会对SB抗宫颈癌的活性和作用机制做进一步的研究。SB在体外实验和动物实验中均有较好的抗宫颈癌作用，拓展了目前临床治疗恶性肿瘤的思路，不仅对宫颈癌的临床治疗具有指导意义，还可能作为一种防治恶性肿瘤发生发展、抑制其生长转移的抗肿瘤药物应用于临床。
　　参考文献
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