外周血单个核细胞NF-rB活性与急性缺血性脑卒中的相关性研究

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　　[摘要]目的探討外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）中细胞核因子rcB（nuclearfactorkappaB，NF-kB）活性预测急性缺血性脑卒中（acuteischemicstroke，AIS）患者神经功能预后的临床价值。方法连续性纳入在我院治疗的74例AIS患者，通过流式细胞术分析AIS患者的PBMC中的NF-rcB活性，并与健康人群进行对照比较。以90天改良Rankin量表（mRS）评分大于2分为主要评价指标，评估NF-rB活性对神经功能预后不良的预测价值。结果AIS患者的PBMC中平均NF-kB活性显著高于健康对照人群[（28.32+8.70）%：（13.19+4.51）%，P<0.01]。预后不良组患者的PBMC中NF-rB活性显著高于预后良好组患者[（32.60+4.82）%：（23.42+6.51）%，P<0.01]。与预后良好组相比，预后不良组患者的年龄更高[（62.12±12.83）岁：（53.32±13.41）岁，P=0.02]、合并心房颤动更多（35.39%：12.28%，P=0.03）、入院时NIHSS评分更高[（15.78±3.43）分：（11.23+4.51）分，P<0.01]。ROC曲线显示PBMC中NF-kB活性对神经功能预后不良的预测阈值为28.20%，灵敏度为87.31%、特异度为72.12%。多因素Logistics回归分析显示NF-cB活性>28.20%（OR=2.44，95%CI：1.78～3.92，P<0.01）和入院时美国国立卫生研究院脑卒中量表（NIHSS）评分>14分（OR=1.65，95%CI：1.14～2.58，P=0.02）是影响AIS患者神经功能预后不良的独立危险因素。结论AIS患者PBMC中NF-rB活性显著升高，并且升高的NF-rB活性与AIS患者的神经功能预后不良独立相关。
　　[关键词]急性缺血性脑卒中;外周血单个核细胞;细胞核因子cB
　　中图分类号：R743.33
　　文献标识码：A
　　文章编号：1009-816X（2019）06-0513-04
　　doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.06.008
　　Correlation between Nuclear Factor Kappa B （ NF-KB ） Activity in Peripheral Blood ， Mononuclear Cell and Acute Ischemic Stroke. HUANG Miao， KANG Lin-E， BAI Yan-yan. Department of Neurology， Yulin First Hospital ， Shaanxi 719000， China
　　[ Abstract ] Objective To investigate the clinical value of nuclear factor kappa B （ NF-KB ） activity in peripheral blood mononuclear with healthy controls. The 90-Day modified Rankin scale（ mRS ） score > 2 was set as the main evaluation indicator， and evaluated was significantly higher than that of healthy controls（ 28.32 t 8.70% vs 13.19+4.51%， P <0.01 ）. The NF-KB activity in PBMC of patients with poor prognosis was significantly higher than that of patients with well prognosis（ 32.60+4.82% vs 23.4216.51 % ， P<0.01 ）. Compared with the well prognosis group， the patients with poor prognosis were older （ 62.12t 12.83 years vs 53.32 t 13.41 years， P= 0.02）， with more atrial fibrillation （ 35.39% vs 12.28%， P =0.03 ）， and higher NIHSS score at admission （ 15.7813.43 points vs 11.2314.51， P<0.01 ）. The ROC curve showed that the predictive threshold of NF-KB activity in PBMC for poor neurological prognosis was 28 .20%， with the sensitivity of 87.31 % and specificity of 72. 12% . Multivariate logistic regres-sion analysis showed NF-KB activity > 28 .20% （ OR=2.44， 95% CI： 1.78～3.92， P<0.01 ） and NIHSS score at admission > 14.00（ OR=1.65， 95% CI： 1.14～ 2.58， P = 0.02 ） were independent risk factors for affecting the poor neurological function ofcell （ PBMC ） in predicting neurological prognosis in patients with acute ischemic stroke （ AIS ）. Methods 74 patients with AIS treated in our hospital were continuously enrolled. Flow cytometry was used to analyze NF-KB activity in PBMC of AIS patients and compared the predictive value of NF-KB activity for poor neurological prognosis. Results The mean NF-KB activity in PBMC of patients with AIS in patients with AIS. Conclusions NF-KB activity was significantly elevated in PBMC of patients with AIS， and elevated NF-KB activity was independently associated with poor neurological prognosis in patients with AIS. 　　[Key words ] Acute ischemic stroke; Peripheral blood mononuclear cell; Nuclear factor kappa B
　　急性缺血性脑卒中（acuteischemicstroke，AIS）是因大脑血容量突然减少而导致脑组织迅速死亡，严重影响患者健康和神经功能的疾病[1].近年来的研究
　　提出免疫和炎症反应在脑卒中的疾病进展和所有阶段中起到关键性作用，包括脑卒中的急性发展和脑卒中后的长期恢复[2]。而炎症因子成为目前AIS研究的热点。细胞核因子reB（nuclearfactorkappaB，NF-kB）是一种能够促进多种炎症因子表达的转录因子，处于炎性反应的核心位置，具有抗炎和促炎的双重作用[3]。但外周血中NF-kB的活性改变与AIS患者疾病严重程度及预后的关系目前少见报道。因此本文主要探讨AIS患者外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）中NF-kB的活性改变及其对预后的影响。
　　1资料和方法
　　1.1一般资料：连续性纳入2017年1月至2017年12月间在我院治疗的AIS患者74例，其中男38例，女36例，年龄43～83岁，平均（54.21±12.32）岁。纳入标准：（1）符合<中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014版>诊断标准[4]，经头颅CT或MRI检查确诊;（2）神经功能障碍，即入院时美国国立卫生研究院脑卒中量表（nationalinstituteofhealthstrokescale，NIHSS）评分>2分;（3）首次发病;（4）脑卒中发病8h以内;（5）近3个月内未使用激素、免疫抑制剂或细胞毒性药物。排除标准：（1）外伤性脑出血、动脉瘤或动脉硬化、蛛网膜下腔出血等;（2）合并自身免疫性疾病或急慢性感染状态;（3）合并重要脏器功能障碍或衰竭。本研究同期招募了40例年龄匹配、且无脑卒中病史、无自身免疫性疾病或急慢性感染状态的健康体检人群作为对照组。本研究经本院伦理委员会审核通过，并经受试者及其家属签署知情同意书。
　　1.2方法：
　　1.2.1PBMC中NF-kB活性检测：AIS患者在入院后即刻抽取肘静脉血、对照组在清晨空腹抽取静脉血，采用流式细胞仪检测NF-kB活性。步骤如下：（1）制备PMBC悬浮液：取2mL经EDTA抗凝处理的血液样本，加入2mL溶血素，充分混匀后室温静置25～30min，2000r/min离心5min，共2次，弃上清，加入1mLPBS缓冲液，摇匀后加入150μLA液，静置10min后加人150pLB液，静置10min后重复上述步骤一遍。（2）染色：向上述制備好的PBMC悬液中加入0.2mLPBS缓冲液，调整细胞数目为1.0x10%/mL，吸取约10μL细胞悬液置于载玻片中，Wright-Giemsa染色1次，显微镜下观察PBMC悬液是否制备成功。（3）流式染色：直接向成功制备的PBMC悬液中加入0.5pL的NF-kB抗体（NF-kBp65McAb，美国SantaCruz公司），室温静置1h后加入40μLFTTC标记的IgG（1：100稀释），室温下静置30min，再加入20μLPI染料，暗室内静置5min。（4）流式检测：采用流式细胞仪（美国BectonEDickinson公司，FACS400型）检测NF-kB活性。
　　1.2.2观察指标：所有患者在入院时、入院后24h和出院时进行NIHSS评分，并在发病后90d通过改良Rankin量表（mRS）评估AIS患者的神经功能情况。以90d时的mRS评分为主要观察指标，其中mRS评分≤2分为神经功能恢复良好，而mRS为3～6分认为神经功能预后不良。
　　1.3统计学处理：采用SPSS23.0版软件进行统计学分析。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料以例数（%）表示，组间比较采用卡方（x2）检验。采用受试者工作特征曲线（receiveroperat-ingcharacteristic，ROC）和曲线下面积（AUC）分析NF-kB活性对AIS神经功能不良预后的预测价值及预测阈值;通过单因素及多因素Logistic回归分析确定影响AIS患者神经功能预后的独立危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1AIS患者的PBMC中NF-kB活性：AIS患者的PBMC中平均NF-kB活性为（28.32+8.70）%，而对照组的平均NF-kB活性为（13.19±4.51）%，差异存在统计学意义（t=10.25，P<0.01），见图1。
　　2.2AIS患者神经功能预后分组比较：根据90d时mRS评分将74例患者分为预后良好组（57例）和预后不良组（17例）。与预后良好组比较，预后不良组患者的年龄更高、合并心房颤动更多、入院时NIHSS评分更高，NF-kB活性显著更高差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　2.3NF-xB活性对神经功能预后的预测价值分析：PBMC中NF-xB活性对神经功能预后不良的预测价值AUC=0.87（P<0.01），阈值为28.20%，灵敏度为87.31%、特异度为72.12%。入院时NIHSS评分对神经功能预后不良的预测价值AUC=0.76（P<0.01），阈值为14.00，灵敏度为69.41%、特异度为77.52%。见图2。
　　2.4影响AIS患者神经功能预后不良的独立危险因素分析：以年龄、心房颤动、入院时NIHSS评分、NF-kB活性为自变量，神经功能预后不良为因变量进行多因素Logistics回归分析。结果显示NF-kB活性>28.20%和入院时NIHSS评分>14分是影响AIS患者神经功能预后不良的独立危险因素，见表2。 　　3讨论
　　AIS是神经系统的常见病、多发病，具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点，是人类疾病的三大死亡原因之一[5]。AIS的病理生理机制十分复杂，传统的观点认为脑血流阻断导致的脑组织缺血、缺氧损害，随后诱发的神经细胞坏死和凋亡是其主要的病理生理机制[6]。但近年来随着相关研究的深人，逐渐发现脑缺血后导致的炎症瀑布反应在脑损伤中的重要地位。已有研究证实，脑缺血后存在明显的炎症细胞聚集增加、促炎因子表达上调，细胞间粘附分子表达增加等炎症反应，提示炎症反应是脑组织缺血再灌注损伤的重要环节[7]。
　　NF-kB是一種具有多向性调节作用的核转录因子，由p50和p60两个蛋白亚基组成。NF-kB是参与细胞内信号转导的重要转录因子，其生物学功能是调控基因、特别是免疫炎症相关基因的转录[8]。一般情况下，NF-xB与抑制因子IkB结合，以非活性形式存在于胞浆中，当在外界信号作用下，IkB发生磷酸化进而降解，与NF-kB解离并移人核内，激活相应基因的转录而发挥作用，从而参与机体的免疫和炎症反应[9]。本研究发现，与对照组比较，AIS患者PBMC中NF-kB的活性明显升高，表明AIS患者体内存在NF-kB的表达和激活异常，这种异常可能通过调控许多基因特别是免疫炎症相关基因的转录表达，从而参与机体的免疫和炎症反应，参与了AIS发展。此外，本研究还发现神经功能预后不良的AIS患者的NF-kB活性显著高于神经功能预后良好的AIS患者，表明NF-kB在AIS的疾病进展中起到一定的作用。进一步通过ROC曲线发现PBMC中NF-kB活性超过28.20%是预测AIS患者神经功能预后不良的最佳阈值，灵敏度达87.31%、特异度达72.12%。并且通过多因素Logistics回归分析证实了PBMC中NF-kB活性超过28.20%是影响AIS患者神经功能预后不良的独立危险因素，提示PBMC中NF-kB活性能够有效评估AIS患者的神经功能改善及预后情况。
　　由于NF-kB的活化炎症反应是复杂细胞因子网络的中心环节[10]。而本研究发现AIS患者的外周血PBMC中NF-kB活性显著高于健康人群，同时NF-kB升高预示了AIS患者的神经功能预后不良。因此遏制NF-kB的活化，从而减少多种炎症介质的产生，为AIS患者的治疗和预后管理提供了新的思路，为临床防治并发症提供新的证据。
　　综上所述，本文证实AIS患者处于NF-kB活化的状态，并且NF-kB活性是影响AIS患者神经功能预后不良的独立危险因素，为临床诊断和随访AIS及其神经功能预后情况提供了新的检测指标。但由于本研究仅为单中心小样本的，因此仍需要进一步通过多中心、大样本的前瞻性研究证实本研究结论。
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　　（收稿日期：2019-3-26）
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