microRNA在非酒精性脂肪性肝病中的研究进展

来源:用户上传      作者:梅迪华 杜国平

　　【摘要】 非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精、病毒感染及其他明确病因所致的以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为主要特征的临床病理综合征。随着人们生活水平的不断提高，NAFLD的发病率明显升高。目前NAFLD已成为世界上最常见的慢性肝脏疾病，严重威胁人们的健康，但其发病机制尚不明确。微小RNA（microRNA，miRNA）是长度约为22个核苷酸的具有调控功能的内源性非编码RNA，miRNA与NAFLD中的脂质代谢、胰岛素抵抗、炎症反应、细胞凋亡、纤维化等环节有着密不可分的关系。本文主要就miRNA在NAFLD发生发展过程中发挥的重要作用做一综述，以期未来成为NAFLD新的诊断指标及治疗靶点。
　　【关键词】 microRNA 非酒精性脂肪性肝病 差异性表达
　　Advances in the Study of microRNA in Non-alcoholic Fatty Liver Disease/MEI Dihua， DU Guoping. //Medical Innovation of China， 2020， 17（02）： -168
　　[Abstract] Non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） refers to a clinicopathic syndrome characterized by alcoholic， viral infection and other definite causes of hepatic parenchymal cell steatosis and fat storage. With the continuous improvement of people’s living standards， the incidence of NAFLD has increased significantly. At present， NAFLD has become the most common chronic liver disease in the world， which is a serious threat to people’s health， but its pathogenesis is still unclear. microRNA （miRNA） is endogenous non-coding RNA with regulatory functions， which is approximately 22 nucleotides in length. Studies have shown that miRNA has a close relationship with lipid metabolism， insulin resistance， inflammation， apoptosis， and fibrosis in NAFLD. This article reviews the important role of miRNA in the development of NAFLD， in the hope of becoming a new diagnostic indicator and therapeutic target for NAFLD in the future.
　　[Key words] microRNA Non-alcoholic fatty liver disease Differential expression
　　First-author’s address： Graduate School of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000， China
　　doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.02.042
　　非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精、病毒感染及其他明確病因所致的以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为主要特征的临床病理综合征，疾病谱包括单纯性脂肪肝（non-alcoholic simple fatty liver disease，NAFL）、非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝癌[1]。近年来，世界各地NAFLD发病率均在升高，全世界NAFLD的患病率为25.24%[2]，其中北美洲24.1%，欧洲23.7%，NAFLD已成为世界上最常见的慢性肝脏疾病。随着我国经济的不断发展，人民生活水平的不断提高，生活习惯和饮食结构发生巨大改变，且NAFLD常常和肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、脂代谢紊乱、高血压等合并存在，使我国NAFLD的发病率大大提高，目前我国NAFLD患病率为20.09%，上海等华东地区NAFLD患病率竟高达43.3%[3]，这对我国人民的健康造成巨大危害。
　　目前对NAFLD的发病机制尚不清楚，“二次打击”学说是目前受到广泛认同的经典发病机制。第一次打击与胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱密切相关。游离脂肪酸在肝脏β-氧化的主要场所为线粒体、微粒体和过氧化物酶体。胰岛素抵抗和高胰岛素血症促进了外周脂肪组织释放游离脂肪酸入肝，加速了肝细胞对游离脂肪酸的利用，促使了过量的甘油三酯在肝脏合成。而肝细胞对游离脂肪酸的过度摄入又会导致线粒体氧化磷酸化和脂质β-氧化呈超负荷状态，极低密度脂蛋白合成或分泌减少，甘油三酯转运异常，加重肝脏脂肪堆积，导致肝细胞脂肪变性，形成单纯性脂肪肝。在首次打击的基础上，产生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），一方面当ROS的产生及其作用超过肝细胞本身的抗氧化系统清除能力时，便会诱导肝实质细胞的氧化应激反应，另一方面ROS与不饱和脂肪酸反应形成大量的脂质过氧化产物（lipid per oxide，LPO），LPO通过抑制线粒体呼吸链的电子传递，又会产生大量的ROS与LPO，形成恶性循环，从而导致肝细胞炎症反应、凋亡、坏死，最终引起肝脏纤维化、肝硬化和肝细胞癌，此为“第二次打击”[4]。然而，随着研究的不断深入，人们发现“两次打击假说”已经开始过时，因为它不足以解释NAFLD中发生的所有分子和代谢变化。越来越多的人认为，多种因素作用于患者以诱导NAFLD，这些因素包括胰岛素抵抗、从脂肪组织分泌的激素、营养因子、肠道菌群、遗传和表观遗传因子等[5]。多种因素的联合分析更能准确地解释NAFLD的发病机制，这种说法被称为“多重打击”假说[6]。 　　微小RNA（microRNA，miRNA）是长度约为22个核苷酸的具有调控功能的内源性非编码RNA，广泛存在于真核生物中。成熟的miRNA由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生，随后组装进RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex），miRNA中5’端中的“种子区域”通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA的3’非翻译区（3’-UTR），并根据配对互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。miRNA具有广泛的生物调节功能，与机体生长发育、细胞代谢、增殖、分化、凋亡、肿瘤形成等密切相关[7]。最近研究表明，miRNA与NAFLD中的脂质代谢、胰岛素抵抗、炎症反应、细胞凋亡等环节有着密不可分的关系[8]。本文主要就miRNA在NAFLD发生发展过程中发挥的重要作用做一综述，以期未来成为NAFLD新的诊断指标及治疗靶点。
　　1 NAFLD发展过程中miRNA的表达谱变化
　　多项研究表明，NAFLD中存在miRNA的差异性表达，Cheung等[9]通过对比15例NASH患者及15例健康者的肝组织中miRNA的基因谱芯片数据分析，并采用逆转录PCR（RT-PCR）对芯片结果进行验证，提示包括miR-34a和miR-146b的23种
　　miRNA表达上调，包括miRNA-122在内的23种miRNA表达下调。此外，在NAFLD发生发展的不同阶段，miRNA的差异性表达情况也各不相同。Miyaaki等[10]在NAFLD患者的肝脏和血清中检测miR-122，发现其在单纯脂肪肝变性或者NASH中表达明显上调，且与肝细胞脂肪变性严重程度呈正相关。但在肝纤维化中miR-122表达明显下调，与肝纤维化严重程度呈负相关，揭示了miR-122在NAFLD不同的病变发展阶段，表达水平也存在差异。见表1。
　　2 miRNA参与调节NAFLD的研究进展
　　通过对NAFLD中miRNA差异性表达的进一步研究，研究人员发现miRNA参与到调控NAFLD的各个病理改变过程，尤其是miRNA-34a、miRNA-122、miRNA-29、miRNA-21等与NAFLD中葡萄糖及脂质代谢、氧化应激、炎症反应的发生发展过程密切相关[8]。下面就以上miRNA近几年来对NAFLD发病的具体调控机制做一阐述。
　　2.1 miRNA-34a 大量研究表明，miRNA-34a可能参与到NAFLD中脂质代谢、氧化应激、凋亡等相关信息通路中[22-25]。在NAFLD中miR-34a与沉默信息调节因子1（SIRT1）相关。SIRT1是一种依赖于NAD的去乙酰化酶，作为NAD的主要代谢传感器，在包括NAFLD在内的代谢疾病中起着至关重要的作用。Castro等[22]研究发现，miR-34a通过抑制SIRT1表达，促进p53乙酰化作用及转录，使促凋亡基因puma增加，从而参与肝细胞的凋亡，即miR-34a/SIRT1/p53通路参与调控肝细胞凋亡过程。
　　p66shc是SHCA适配器分子的一个异构体，是一种氧化还原酶，参与促进线粒体氧化信号的凋亡。Shan等[23]发现，在高脂肪饮食大鼠体内及胆酸诱导的肝细胞中，过表达的miR-34a通过抑制SIRT1表达，增加了p66shc的表达水平，促进ROS的氧化应激反应，诱导细胞凋亡。而鼠尾草酸（carnosic acid，CA）通过抑制miR-34a/SIRT1/p66shc信号通路，导致Caspase-3水平明显降低，Bcl-XL上调，对NAFLD肝细胞凋亡起到保护作用。
　　过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）作為核激素受体家族中的一员，具有调控细胞代谢的作用，而PPARα作为PPARs其中的一个亚型，主要在肝脏中调控脂肪酸（FA）代谢酶和线粒体FA氧化（FAO）活性基因的组成转录，通过激活线粒体和过氧化物酶体脂肪酸β-氧化途径，实现对脂质的转运和代谢调节。Ding等[24]发现，PPARα作为miR-34a的直接靶向目标基因，在使用miR-34a抑制剂后其蛋白表达水平上调，通过诱导CPT1和CPT2（均参与脂肪酸β-氧化），SLC27A1、SLC27A4和ACBD3（均参与脂肪酸转运）等脂质代谢基因的转录，导致甘油三酯及肝脏指数的下调，激活AMPK通路，最终PPARα和pAMPKα1的表达上调增加了脂肪氧化，即miR-34a-PPARα-AMPK途径参与到NAFLD脂肪变性的调节过程。
　　此外，miR-34a-HNF4α（肝细胞核因子4α）通路也能调节肝脏和血浆的脂质代谢[25]。miR-34a通过结合到3’UTR的第二个结合位点，抑制HNF4α的表达，并以一种依赖HNF4α的方式抑制VLDL的分泌，导致肝脏甘油三酯积累，引起脂肪变性。同时该通路引起血浆中甘油三酯及胆固醇的减少，对动脉粥样硬化起到一定的预防和保护血管的作用。
　　2.2 miRNA-122 miRNA-122是肝脏中表达最丰富的微小RNA，约占肝脏miRNA的70%。miRNA-122是肝脏中脂质代谢的关键因素。在HepG2细胞的体外研究中发现，miR-122的沉默导致脂质代谢基因，例如脂肪酸合成酶（FAS）、HMGCR还原酶、固醇结合元件结合蛋白（SREBP）等表达的上调[10]。Miyaaki等[10]发现miR-122在单纯脂肪肝变性或者NASH中表达明显上调，且与肝细胞脂肪变性严重程度呈正相关。CYP7A1是胆固醇合成胆汁酸的限速酶。在慢病毒介导的抑制miR-122表达的肝细胞中，CYP7A1表达上调，从而增加胆汁酸的产生并降低肝细胞中的胆固醇水平，表明肝脏胆固醇水平的降低可能继发于miR-122的抑制，miR-122是胆固醇代谢的关键调节因子[26]。除此之外，miR-122还能介导控制AMPK和PPAR家族等昼夜节律代谢调节因子的表达，调节脂质代谢，而miR-122基因的转录本身发生在昼夜节律中，表明miR-122、昼夜节律基因表达和肝脏脂质代谢之间存在联系[27]。 　　同时miR-122在NAFLD的炎症反应及纤维化中起着关键作用。白细胞介素-1A（IL-1A）是一种与炎症反应相关的多向性细胞因子，它分为DD、ID及Ⅱ三种基因型，其中DD基因型携带者中的血清IL-1A高于携带ID和Ⅱ基因型NAFLD患者。研究发现，miRNA-122表达水平与血清IL-1A呈正相关，miR-122通过调控携带高风险DD基因型的IL-6基因的转录水平，参与NAFLD的炎症反应，增加了个体患上NAFLD的风险[28]。Bandiera等[27]研究表明，表达miR-122基因缺失的小鼠，在补充了miR-122后能够抑制趋化因子CCL2，从而减少在肝内募集CD11bhiGr1+的炎症细胞及促纤维化Krüppel样因子6（KLF6）的表达，改善炎症反应。Hossein等[26]发现在慢病毒介导的抑制miR-122表达的多细胞三维人肝器官模型中，库普弗细胞（Kupffer cell，KC）能促进各种炎症因子（IL-1b、IL-12、TNF-α）和促纤维化细胞因子（如CCL2、CCL3、CCL5）的分泌，导致进一步的肝细胞损伤和损伤相关分子模式（DAMP）的释放，诱导加强KCs、肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）活化并引发炎症及纤维化反应。以上说明，miR-122除了对肝脏脂质代谢产生重要影响，对NASH和肝纤维化也起着关键作用。
　　此外，缺失miR-122的小鼠易于快速发展为脂肪性肝炎、纤维化和肝癌[29]。而miR-122可以结合Wnt1 mRNA的30’-UTR进行抑制，下调Wnt1、β连环蛋白和TCF-4的蛋白水平，抑制Wnt信号通路，达到促进细胞凋亡的目的。这表明HCC中miR-122的缺失可能导致过量的Wnt信号通路传导，肝脏miR-122的失调有助于NAFLD向HCC发展[30]。
　　2.3 miRNA-29 miRNA-29家族是胰腺及肝脏中表达最丰富的miRNA之一。据报道，miR-29是糖尿病的早期标志物，在小鼠模型的胰腺中，miR-29协同上调miR-29a-c，随后抑制Bcl-2家族蛋白的抗凋亡因子mcl-1，使胰岛b细胞发生凋亡，形成1型糖尿病[31]。Pandey等[32]发现，在糖尿病小鼠肝脏中，miR-29a水平明显升高，它通过靶向抑制胰岛素信号级联中的上游分子PI3K（磷酸肌醇-3-激酶）的表达，以及阻断胰岛素信号下游AKT（蛋白激酶B）磷酸化途径，形成胰岛素抵抗。而胰岛素抵抗是NAFLD的发病机制之一，这意味着miR-29家族可能是通过胰岛素抵抗途径参与NAFLD发生发展的关键因素。
　　Duan等[33]研究表明，远程缺血预处理（remote ischemic preconditioning，RIPC）对NAFLD肝脏缺血再灌注损伤（ischemia and reperfusion，IR）有保护作用，具体机制为RIPC降低了骨骼肌中miR-29a/b/c的表达水平，而miR-29a/b/c通过直接针对诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的3’-UTR而下调iNOS的表达，减少一氧化氮的产生。因此，笔者推测miR-29家族也能调控NAFLD中氧化应激产物基因的转录水平，参与到肝脏的氧化应激反应过程。
　　陈轶等[34]发现miR-29b在NAFLD肝纤维化、肝硬化患者血清中的表达明显下降，提示miR-29b与NAFLD纤维化过程密切相关。Wang等[35]研究发现，miR-29b在人和小鼠纤维化肝组织和原代活化的肝星状细胞（HSC）中显著下调，Smad3通过与miR-29b启动子结合，介导TGF-β1诱导miR-29b下调。而下调的miR-29b又能抑制Smad3表达，减轻对TGF-β1及TGF-β1诱导的促纤维化基因表达的抑制作用，进而放大TGF-β1引起的纤维化信号。此外，miR-29b通过下调p-smad 3、α-sma、Ⅰ型胶原和TIMP-1蛋白表达，对HSC的活化产生抑制作用，同时miR-29b通过直接靶向PIK3R1及AKT3的3’TR区域，抑制他们的下游效应子α-SMA和Ⅰ型胶原的表达，从而诱导细胞凋亡。总之，miR-29b通过抑制PI3K/AKT途径抑制HSC活化和诱导HSC凋亡。虽然这些调控机制不是在NAFLD模型中阐明，但鉴于NAFLD也存在肝纤维化、肝硬化进程，提示miR-29b也可能在NAFLD向肝硬化发展的过程中起作用，其作用的靶点也有可能是一致的。
　　2.4 miRNA-21 最近研究发现，miRNA-21与NAFLD中的糖脂代谢、炎症反应、纤维化以及发展成为肿瘤等过程有着密切的关系[36-40]。Benhamouche-Trouillet等[36]发现，敲除了miR-21基因的小鼠肝脏中，葡萄糖耐量以及胰岛素抵抗得到明显改善，具体机制可能是miR-21的缺乏使雷帕霉素不敏感的mTOR伴侣（RICTOR）和胰岛素受体底物2（IRS2）的上调和信号传导及转录激活因子3（STAT3）和AKT蛋白质含量以及磷酸化的增加。Rodrigues等[37]研究表明，miR-21的下调可能导致PPARα的增加，同时参与奥贝胆酸激活法尼醇受体（farnesoid X receptor，FXR）的过程，降低甘油三酯和游离脂肪酸的水平。Li等[38]在HepG2细胞中转染miR-21模拟物后，发现低密度脂蛋白受体相关蛋白6（low-density lipoprotein receptor-related protein 6，LRP6）在mRNA和蛋白质水平的转录和翻译受到抑制，而miR-21的减少使LRP6的表达水平上升。同时miR-21模拟物在HepG2细胞中的转染也引发关键的脂质代谢酶表达，包括乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（1SCD1）、固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）和肝X受體α（LXRα），最终诱导脂质产生。Wu等[39]在高脂肪饮食处理的小鼠肝脏和用脂肪酸孵育的人HepG2细胞中，发现HMG盒转录因子1（HMG-box transcription factor 1， 　　HBP1）是miR-21的新靶點和p53的转录激活因子，而p53是抑制Srebp1c的肿瘤抑制因子和脂肪生成抑制剂。miR-21的减少导致HBP1和p53的增加，从而减少脂肪生成并延迟G1/S转换，抑制肝癌发生发展。即miR-21通过与Hbp1-p53-Srebp1c途径相互作用促进肝脏脂质积聚和癌症进展。曹海军等[40]研究发现，与正常大鼠肝脏相比，随着肝纤维化的进展，肝纤维化大鼠模型组肝脏的miR-21的表达水平逐渐上升，Smad7的表达水平逐渐下降，且miR-21与Smad7呈负相关的关系，揭示了miR-21经TGF-β1/Smad7信号通路参与肝纤维化的发生。
　　3 展望
　　随着人民生活水平的不断提升，NAFLD的发病率急剧上升，但其发病机制尚不明确，且没有被批准用于治疗NAFLD的药物。miRNA在多种肝脏疾病中均扮演着重要角色，最近研究表明，miRNA参与调控NAFLD中葡萄糖及脂质代谢、氧化应激、炎症反应、肝纤维化、肝硬化及肝癌等过程[8]。虽然mi-RNA种类繁多，调控NAFLD的具体作用机制尚不完善，但随着对miRNA研究的不断深入，未来将为NAFLD诊断及治疗提供一种新的思路和手段。从异常表达的miRNA了解NAFLD的发展程度，同时miRNA作为NAFLD的治疗靶点达到治疗疾病的目的。
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　　（收稿日期：2019-11-12） （本文编辑：张爽）
　　①广东医科大学研究生学院 广东 湛江 524000
　　②南方医科大学顺德医院
　　通信作者：杜国平
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