苦参碱对TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞ETS2表达的影响

来源:用户上传      作者:李福记 梁靖梅 段秀萍

　　[摘要] 目的 转录因子ETS2在器官纤维化的发生及进展中具有重要的作用，研究苦参碱对其在腹膜间皮细胞中表达的影响及其对腹膜纤维化防治的重要意义。 方法 将人腹膜间皮细胞按处理方法分为空白对照组、TGF-β1诱导组、TGF-β1+0.4 mg/mL苦参碱干预组、TGF-β1+0.8 mg/mL苦参碱干预组和TGF-β1+1.2 mg/mL苦参碱干预组，TGF-β1刺激人腹膜间皮细胞并分别予不同浓度的苦参碱干预处理，相对实时荧光定量PCR检测α-SMA和E-cadherin的mRNA表达水平，然后用mRNA-seq分析ETS2的mRNA表达水平，相对实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹验证ETS2的mRNA和蛋白的表达水平。 结果 TGF-β1刺激能上调人腹膜间皮细胞ETS2的mRNA和蛋白的表达水平，上调α-SMA的mRNA表达水平，下调E-cadherin的mRNA表达水平;苦参碱能下调TGF-β1刺激后的ETS2基因mRNA和蛋白的表达水平，下调TGF-β1刺激后α-SMA的mRNA表达水平和上调TGF-β1刺激后的E-cadherin的mRNA表达水平。 结论 苦参碱通过抑制转录因子ETS2的表达阻止人腹膜间皮细胞间充质转化。
　　[关键词] 苦参碱;ETS2基因;人腹膜间皮细胞;间充质转化
　　[Abstract] Objective The transcription factor ETS2 plays an important role in the occurrence and progress of organ fibrosis. It is important to study the effect of Matrine on its expression in peritoneal mesothelial cells and its prevention and treatment of peritoneal fibrosis. Methods HPMC were divided into blank control group， TGF-β1-induced group， TGF-β1+0.4 mg/mL matrine intervention group， TGF-β1+0.8 mg/mL matrine intervention group and TGF-β1+1.2 mg/mL matrine intervention group， according to different processing methods. TGF-β1 was applied to stimulate HPMC and treated with matrine intervention of different concentrations. The mRNA expression levels of α-SMA and E-cadherin were detected by relative real-time fluorescent quantitative PCR， then the mRNA expression levels of ETS2 were analyzed by mRNA-seq， and the mRNA and protein expression levels of ETS2 were verified by relative real-time fluorescent quantitative PCR and immunoprotein printing. Results TGF-β1 stimulation can up regulate the expression level of ETS2 mRNA and protein， up regulate the expression level of α-SMA， down regulate the expression level of E-cadherin mRNA. Matrine can down regulate the expression level of ETS2 gene mRNA and protein after TGF-β1 stimulation， down regulate the expression level of α-SMA after TGF-β1 stimulation and up regulate the expression level of E-cadherin after TGF-β1 stimulation. Conclusion Matrine can prevent mesenchymal transformation of HPMC by inhibiting the expression of transcription factor ETS2.
　　[Key words] Matrine; ETS2 gene; Human peritoneal mesothelial cells; Mesenchymal transformation
　　人腹膜間皮细胞在终末期肾病（End-stage renal disease，ESRD）患者腹膜透析中具有重要的生物学功能，长期腹膜透析过程中腹膜间皮细胞不断受物理和炎症等刺激会发生间充质转化，最终发展为腹膜纤维化。由此可见，腹膜间皮细胞间充质转化是腹膜纤维化发生发展的早期重要过程[1]。腹膜透析是ESRD患者重要替代疗法之一[2，3]，而腹膜纤维化的发生会导致超滤量下降，患者无法再进行腹膜透析。因此，研究腹膜间皮细胞间充质转化的分子机制并探索抑制其转分化的相关药物，对防治腹膜纤维化具有重要意义。
　　转化因子ETS2具有E26转换特异性序列，它能与位于靶基因启动子区域的特异性核心GGAA/T序列相互作用，并调控该区域许多基因的转录[4，5]。研究证实ETS2参与多种细胞功能，包括凋亡、增殖、转化、迁移和血管生成[6，7]。此外，还有许多研究报道了ETS2通过调节基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）和ECM蛋白的表达参与细胞外基质重构及影响肿瘤的发生、创伤的修复和心血管疾病的发生[8-10]。近年来，研究表明ETS2也参与了肺和肾脏等器官纤维化的发生与发展[11，12]。本研究ETS2在TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞间充质转化中的作用分子机制及苦参碱对其表达的影响，为寻求有效抑制腹膜间皮细胞间充质转化的新方法提供科学依据，现报道如下。 　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　人腹膜间皮细胞系（HPMC）购买于广州吉赛科技有限公司，苦参碱购于北京博奥拓达科技有限公司（CAS NO：16837-52-8），ETS2、α-SMA和E-cadherin单克隆抗体购于CST公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 实验分组  将人腹膜间皮细胞按照不同处理方法分为空白对照组（完全培养基培养48 h）、TGF-β1诱导组（给予5 ng/mL TGF-β1刺激48 h）、TGF-β1+0.4 mg/mL苦参碱干预组（给予5 ng/mL TGF-β1+0.4 mg/mL苦参碱处理48 h）、TGF-β1+0.8 mg/mL苦参碱干预组（给予5 ng/mL TGF-β1+0.8 mg/mL苦参碱处理48 h）和TGF-β1+1.2 mg/mL苦參碱干预组（给予5 ng/mL TGF-β1+1.2 mg/mL苦参碱处理48 h）。
　　1.2.2 人腹膜间皮细胞培养及药物干预  复苏细胞并传代培养，待细胞长至80%融合时胰酶消化，接种于6孔板中培养，待细胞长至70%～80%时进行干预实验。诱导人腹膜间皮细胞EMT的TGF-β1浓度为5 ng/mL，苦参碱干预处理的浓度分别为0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.2 mg/mL。
　　1.2.3 相对实时荧光定量PCR（RT-PCR）和免疫蛋白印迹  RT-PCR：细胞干预处理48 h后收集细胞，根据天根RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，紫外分光光度计测量RNA浓度与纯度，琼脂糖凝胶电泳验证完整性后，根据Takara逆转录试剂盒说明书合成单链cDNA，以cDNA为模板在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上扩增目的片段。扩增引物在Pubmed数据库中在线设计，送上海生物工程股份有限公司进行合成（序列见表1）。免疫蛋白印迹：收集细胞提取总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转PVDF膜，抗原封闭1 h后，4℃孵育一抗过夜，二抗孵育1 h，全能型凝胶成像系统成像。
　　1.2.4 mRNA-seq分析  样品提取总RNA后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer，使其片断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链，经过Quick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina HiSeq 2000进行测序。
　　1.3 统计学方法
　　采用SPSS20.0统计学软件进行分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义;柱状图采用GraphPad Prism 5.0进行绘制。
　　2 结果
　　2.1 苦参碱对人腹膜间皮细胞E-cadherin和α-SMA的mRNA表达水平的影响
　　5 ng/mL TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞间充质转化，同时予0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.2 mg/mL浓度苦参碱干预处理48 h后，实时荧光定量PCR检测E-cadherin和α-SMA的mRNA表达水平。结果显示，5 ng/mL TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞48 h后发现E-cadherin的mRNA表达下调，而α-SMA的mRNA表达上调;低、中和高浓度苦参碱干预处理后发现E-cadherin的mRNA表达上调，而α-SMA的mRNA表达下调。见表2。
　　2.2 mRNA-seq分析ETS2的mRNA表达水平
　　实验分为空白对照组、TGF-β1诱导组和0.8 mg/mL苦参碱干预组处理细胞48 h后提取总RNA送公司进行mRNA-seq结果显示TGF-β1诱导能显著上调ETS2，而苦参碱干预后能显著下调ETS2的mRNA表达水平。见表3。
　　2.3 RT-PCR和免疫蛋白印迹分别验证ETS2的mRNA和蛋白的表达水平
　　5 ng/mL TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞间充质转化，同时予0.8 mg/mL苦参碱干预48 h后发现ETS2的mRNA和蛋白表达水平显著上调，同时给予0.8 mg/mL苦参碱干预处理能显著下调其mRNA和蛋白表达水平。见图1、表4。
　　3 讨论
　　腹膜间皮细胞间充质转化在腹膜纤维化的发生与发展中起着关键的作用，研究其分子机制并探索有效抑制其间充质转化的药物具有重要意义。研究表明，TGF-β1能诱导小鼠腹膜间皮细胞间充质转化[13]，是导致腹膜纤维化的主要因子之一[14]。本研究通过TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞间充质转化，研究结果显示TGF-β1能下调人腹膜间皮细胞E-cadherin的表达水平和上调人腹膜间皮细胞α-SMA的表达水平。另外，还发现了苦参碱能通过上调E-cadherin的表达水平和下调α-SMA的表达水平对TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞间充质转化具有明显抑制作用。
　　研究表明，TGF-β1刺激人腹膜间皮细胞后会激活Smad依赖和非依赖信号通路，其中Smad依赖信号通路主要通过磷酸化其关键因子Smad2和Smad3，再与Smad4形成异二聚体，然后进入细胞核调控相关靶基因的转录;而Smad非依赖信号通路主要是TGF-β1与其受体结合后通过激活ERK1/2、JNK和PI3K/Akt等信号通路继而调控腹膜间皮细胞间充质转化的相关基因表达[14]。ETS2作为ERK1/2信号通路的下游因子，在肾和肺等器官中的致纤维化作用已有研究报道[11，12]，Yao F等[12]研究认为TGF-β1与其受体结合后会使ERK1/2磷酸化，磷酸化后的ERK1/2再作用于转录因子ETS2，进而调控相关基因的表达使肾小管上皮细胞间充质转化。然而，目前ETS2在腹膜间皮细胞间充质转化及腹膜纤维化中的作用并未见相关研究报道，本研究结果显示TGF-β1能通过下调E-cadherin的表达水平和上调α-SMA的表达水平，诱导人腹膜间皮细胞间充质转化，并通过mRNA-seq分析发现TGF-β1刺激人腹膜间皮细胞间充质转化后，ETS2的表达显著上调，提示ETS2在腹膜间皮细胞间充质转化中也起着重要作用;研究结果还显示了苦参碱能有效抑制TGF-β1诱导后ETS2的异常高表达。这些研究结果提示，苦参碱可能是通过抑制转录因子ETS2的表达来调控腹膜间皮细胞间充质转化相关基因的表达，进而阻止腹膜纤维化的发生与发展。 　　苦參碱是一种具有解热镇痛、抑菌、抗病毒、调节免疫、强心、降压、提高机体免疫力等功效的生物碱。研究表明，其在肝、肺和心脏等器官纤维化中具有抗纤维化的作用[15-17]。本研究结果提示苦参碱在抑制腹膜间皮细胞间充质转化和抗腹膜纤维化中也具有重要作用。
　　综上所述，我们发现TGF-β1能诱导人腹膜间皮细胞间充质转化。同时发现苦参碱能通过上调E-cadherin的表达和下调α-SMA和ETS2的表达抑制TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞间充质转化，提示苦参碱可能抑制转录因子ETS2基因的表达来阻止人腹膜间皮细胞间充质转化的发生，最终防止腹膜纤维化的发生与发展。
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　　（收稿日期：2019-11-27）
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