牛初乳冻干粉及其产品中EGF·TGF—α和IGF—1的含量测定及其变化

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　　摘要 [目的]研究牛初乳冻干粉（LBC）及其产品中表皮生长因子（EGF）、转化生长因子-α（TGF-α）和类胰岛素生长因子-1（IGF-1）含量的变化。[方法]采用冷冻干燥工艺制备0～7 d的LBC和常乳冻干粉（LM），采用酶联免疫分析法测定EGF、TGF-α和IGF-1的含量。[结果]2 d内牛初乳冻干后平均干物质含量为200 g/L。第1天LBC中EGF（7.0 ng/g）、TGF-α（16.8 ng/g）和IGF-1（3.36 μg/g）的含量最高，此后快速下降，第7天接近LM水平。第0～4天LBC中EGF、TGF-α和IGF-1的平均含量分别为5.6 ng/g、9.6 ng/g和2.42 μg/g，分别为LM的7.0倍、13.7倍和6.1倍。3种牛初乳保健食品的EGF和TGF-α含量显著高于LM和2种市售奶粉。初乳素的EGF和TGF-α含量高于其他2种牛初乳保健食品。初乳素的IGF-1含量为1.11 μg/g，极显著高于LM。[结论]研究可为牛初乳产品的进一步开发利用提供理论和试验依据。
　　关键词 牛初乳冻干粉；牛初乳产品；表皮生长因子；转化生长因子-α；类胰岛素生长因子-1；酶联免疫分析法
　　中图分类号 TS207.3 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）09-0096-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.028
　　Abstract [Objective] To study the changes of contents of epidermal growth factor（EGF）， transforming growth factorα（TGFα） and insulinlike growth factor1 （IGF1） in lyophilized bovine colostrums （LBC） during the lactation of 7 days and their contents in bovine colostrums products . [Method] Bovine colostrums from the first day to the 7th days postpartum and milk were prepared into LBC and LM by the freezedrying technology， and the contents of EGF， TGFα and IGF1 were analyzed by enzymelinked immunoassay. [Result] The average dry matter content of bovine colostrums within 2 days was 200 g/L by lyophilization. The highest content of EGF（7.0 ng/g）， TGFα（16.8 ng/g） and IGF1（3.36 μg/g） was found in the LBC of the first day postpartum， then rapidly decreased within 7 days， and the contents on the 7th day were close to LM levels. The average content of EGF， TGFα and IGF1 in LBC within 4 days were 5.6 ng/g， 9.6 ng/g， 2.42 μg/g， which were 7.0， 13.7 and 6.1 times as that in LM. The contents of EGF， TGFα in three bovine colostrums healthcare food （BCHF） were significantly higher than two market milk powder and LM. The contents of EGF， TGFα in prolactin were significantly higher than other two bovine colostrum health food. The content of IGF1 in prolactin was 1.11 μg/g， which was significantly higher than that in LM.[Conclusion] The research could provide theoretical and experimental basis for the further development and utilization of bovine colostrum products.
　　Key words Lyophilized bovine colostrums（LBC）；Bovine colostrums products；Epidermal growth factor（EGF）；Transforming growth factorα（TGFα）；Insulinlike growth factor1（IGF1）；Enzymelinked immunoassay
　　牛初乳是指奶牛分娩后7 d內所分泌的乳汁，它不仅含有人体必需的蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等营养物质外，而且含有大量的生物活性物质。研究表明，牛初乳中含有90多种的生物活性物质，特别是初乳含有大量高浓度的生长因子，如TGF、EGF、IGF-1[1]等。牛初乳是除人初乳以外唯一富含生长因子和免疫因子的天然食物[2]，2000年被美国食品科技协会（IFT）列为21世纪最具发展前景的非草药类天然健康食品。迄今为止，已有报道的除上述几种生长因子外，还有神经生长因子（NGF）、肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、红细胞生成素（EPO）等[3-5]。这些生长因子的提取物作为健康产品，在伤口修复以及治疗小腿溃疡、牛皮癣、克罗恩氏病、肠道黏膜炎、骨质疏松症和在化疗中的细胞保护等方面的应用已有报道[4]。它们作为药物和保健食品的功能因子受到广泛的关注，已经成为生物医药领域的研究热点。 　　目前，对牛初乳中一些生长因子研究主要集中在IGFs，关于TGF-α和EGF报道较少，所用研究样品都是液态初乳，关于牛初乳加工成制剂或产品后的生长因子含量鲜见报道。笔者采用冷冻干燥技术制备0～7 d的牛初乳冻干粉，探讨牛初乳冻干粉中IGF-1、TGF-α和EGF含量的变化规律，并比较几种牛初乳产品中这些生长因子的含量，旨在为牛初乳产品的进一步开发利用提供理论和试验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　采集3头奶牛分娩后0～7 d的牛初乳各500 mL，立即于-20 ℃下冷冻储藏备用；常乳为市售纯牛奶（100%纯牛奶），购自南京卫岗乳业有限公司；乃捷尔牌初乳素胶囊[卫食健字（1997）418号]简称初乳素，功效成分免疫球蛋白含量≥20%，生产批号为20160811，为江苏天美健大自然生物工程有限责任公司产品；产品1（生产批号20160714）和产品2（生产批号20160916）均为市售的牛初乳类保健食品（功效成分免疫球蛋白含量在17%左右）；脱脂奶粉，购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司；全脂奶粉，购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司；EGF和TGF-α的ELISA检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。
　　1.2 仪器与设备
　　GT1型冷冻干燥机，为德国SRK系统技术有限公司产品；智能型超速离心机，为美国贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司产品；Z36HK型高速冷冻离心机，为德国Hermle公司产品；EV300型紫外可见分光光度计，为美国Thermo fisher公司产品；RT-6000型酶标分析仪，为深圳雷杜生命科学股份有限公司产品；DK-8D电热恒温水浴箱，为上海精宏实验设备有限公司产品。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1
　　牛初乳冻干粉（LBC）和常乳冻干粉（LM）的制备。牛初乳和常乳4 000 r/min冷冻离心10 min进行脱脂，脱脂乳于-80 ℃冰箱中冻结后，移至冷冻干燥机内，在高真空度下进行冷冻干燥，加工成LBC和LM，分装后-20 ℃冰箱中保存备用。
　　1.3.2
　　IGF-1含量的测定。用生理盐水将试验样品配制成150 mg/mL的溶液，用玻璃匀浆器匀浆，12 000 r/min 离心20 min（4 ℃），取上清液调节pH至4.6，搅拌30 min，离心除酪蛋白后得到乳清。将乳清pH调至6.4左右，10 000 r/min离心5 min，取上清液参照云振宇等[6]的方法（ELISA法）测定IGF-1的含量。
　　1.3.3 EGF和TGF-α含量的测定。将试验样品用生理盐水配制成150 mg/mL的溶液，用玻璃匀浆器匀浆，15 000 r/min冷冻离心15 min[7]，取上清液用于EGF和TGF-α含量的测定。EGF和TGF-α含量的测定采用ELISA法，按照ELISA检测试剂盒说明书进行测定。
　　1.4 数据统计与分析
　　试验数据使用SPSS 10.0统计软件进行分析，采用方差分析法进行统计学分析，结果均以平均值±标准差表示，P< 0.05表示差异显著。
　　2 结果与分析
　　2.1 1～7 d牛初乳冻干粉的干物质含量变化
　　从图1可以看出，脱脂后牛初乳冻干后的干物质含量随泌乳时间的延长呈下降趋势。第1天LBC的干物质含量为256 g/L，第2天LBC的干物质含量下降了约50%，第1～2天LBC的干物质含量显著高于第3～7天（P<0.05），其平均干物质含量为200 g/L，与Blum等[3]报道相一致。第4天后LBC干物质含量基本稳定在90 g/ L左右。Dzik等[1]认为分娩后24～48 h的牛初乳是最宝贵的，产犊后时间与初乳质量成正比，并且生物活性物质在初乳中的含量随着时间的推移而减少。该研究中LBC在2 d内平均干物质含量为200 g/L，远高于第3～7天。这说明2 d内的LBC含有更多的生物活性物质，这与许多生长因子在分娩后几天内的牛初乳中的高含量相一致。
　　2.2 0～7 d牛初乳冻干粉中EGF、TGF-α和IGF-1含量的动态变化
　　从图2可以看出，LBC中EGF、TGF-α和IGF-1含量在7 d泌乳期内呈下降趋势。EGF在第1天的LBC中含量最高（7.0 ng/g），在第2～4天EGF含量变化较小，第4天后快速降低。TGF-α含量在分娩后1 d为17.5 ng/g，高于0.5 d，在1.5 d时含量下降了33%，此后逐步下降，4.5 d后稳定在2 ng/g左右。IGF-1含量变化与TGF-α相似，在0.5 d時含量最高（3 464 ng/g），4.5 d IGF-1含量迅速降至920 ng/g，第5～7天逐步下降，与文献报道[8-9]基本一致。关于初乳中EGF和TGF-α的含量变化报道，目前仅见于猪初乳[10]和人初乳[11]EGF的报道，它们在分娩后0 h和1 d的EGF含量最高，在72 h和7 d内呈明显下降趋势，牛初乳中EGF和TGF-α的研究也仅限于初乳和常乳中含量的比较[3-4 ]。乳中的生长因子（如IGFs、EGF、TGF和NGF等）通常在泌乳第1天含量最高，此后逐渐下降，最后达到常乳水平[12]。该试验结果显示，在LBC中的这3种生长因子在第1天的含量最高，在第3天仍保持较高含量，此后明显下降，第7天接近常乳水平。加工后的LBC与液态牛初乳呈现相似的含量动态变化，说明合理的加工过程对这些生长因子的含量没有明显影响。同时，对于牛初乳中生长因子等生物活性成分的开发利用，选用3 d内的牛初乳作为原料比较适宜。
　　2.3 牛初乳冻干粉和常乳冻干粉中IGF-1、EGF和TGF-α含量的比较
　　EGF和TGF-α是表皮生长因子家族中最重要的2种生长因子。其中TGF-α是由50个氨基酸组成的多肽，与EGF在结构上有30%～40%的同源性。EGF和TGF-α均可与其共同的受体EGFR结合，从而激活后者自身的酸蛋白激酶，促使DNA合成，从而引起细胞的增殖和分化等一系列反应[12]。笔者测定了LBC中EGF和TGF-α的含量，结果见图2。分娩后第1天LBC中EGF含量最高（7.0 ng/g），显著高于2～7 d的LBC和LM（P<0.05）。第0～4天LBC中EGF平均含量为5.6 ng/g，是LM中含量的7倍，显著高于5～7 d的LBC和LM（P<0.05）。第7天LBC中EGF含量为1.7 ng/g，已接近LM水平。已报道的动物中除啮齿动物以外，人和其他哺乳动物的初乳中EGF含量明显高于常乳[5，13-14]。该研究发现1～6 d LBC中EGF的含量显著高于LM，特别是4 d以内的LBC有较高含量的EGF。TGF是在牛初乳中发现的另一种生长因子，可分为α、β和γ型，目前TGF-β的相关报道较多，而关于TGF-α的研究报道很少[15]。笔者测定了LBC中TGF-α的含量，在0～7 d的LBC中，以分娩后0.5 d（16.2 ng/g）和1 d（17.5 ng/g）LBC中TGF-α 的含量最高，显著高于其他天数。第0～4天的LBC含有较高含量的TGF-α，平均含量为9.59 ng/g，是LM（0.7 ng/g）的13.7倍，显著高于5～7 d的LBC和LM。第4.5～7天LBC中TGF-α的含量在2 ng/g左右，其中第6.5天和第7天的TGF-α含量与LM相比无显著差异。 　　IGF-1是牛初乳中含量最高和研究最深入的一种生长因子，不同研究报道的牛初乳IGF-1含量变化较大，浓度为50～2 000 ng/L[16]，但研究样品都是液态牛初乳，对牛初乳制剂及其制品的IGF-1研究目前仅见Elfstrand等[15]对冻干初乳浓缩粉（5.0 μg/g）和冻干乳清粉（2.3 μg/g）中的含量报道。该研究发现第1天LBC中IGF-1的含量为3.4 μg/g，是LM的8.4倍，0～4 d LBC中IGF-1的平均含量都在μg/g 级水平，远高于LM（0.4 μg/g），与Pakkanen等[16] 的报道较为接近。LBC中高含量的IGF-1为使用牛初乳制剂预防和治疗糖尿病[17-18]等疾病奠定了一定的物质基础。
　　EGF是一种细胞分裂促进因子，能刺激体内多种类型的组织细胞分裂和增殖，特别是初乳中的EGF可有效促进初生动物肠黏膜细胞的增殖与分化[13]，能影响胃肠道一系列酶的活性和肠道吸收功能[11]。TGF-α能够促进人肠上皮细胞细胞的增殖且具有剂量依赖性，能促进人结肠上皮细胞RNA含量的增加和蛋白质的合成[19]。TGF-α也可通过与表皮生长因子受体（EGFR）结合，从而对肠黏膜上皮起到调节保护和促进损伤恢复的作用[12]。IGF-1作为胃肠道的一种有效营养因子，能增加蛋白质的代谢，促进肠黏膜细胞的增殖，维持肠道结构的完整性[20]。该研究结果表明冻干后的牛初乳，特别是0～4 d LBC比LM有更高含量的EGF、TGF-α和IGF-1，提示LBC在预防和治疗胃肠道疾病方面具有很好的应用价值。
　　2.4 牛初乳产品及其乳制品中EGF、TGF-α 和IGF-1含量的比较
　　由表1可知，3种牛初乳保健食品中EGF和TGF-α的含量显著高于LM和2种市售奶粉（P<0.05）。初乳素的EGF和TGF-α含量分别为5.58和11.84 ng/g，显著高于2种牛初乳保健食品（P<0.05）。产品1的EGF含量显著高于产品2（P<0.05）；产品1和产品2的TGF-α含量接近，二者無显著差异。初乳素的EGF和TGF-α含量分别为LM的6.3倍和14.4倍，2种牛初乳产品也含有较高含量的TGF-α（约为LM的11倍）。初乳素是纯牛初乳冻干粉产品，其IGF-1含量为（1.11±0.11）μg/g，极显著高于LM（P<0.01）。Iacopetta 等[21]、孙瑶等[22]通过测定发现人乳中EGF的含量为30～40 ng/mL，远高于牛奶和牛初乳，在几种婴儿配方奶粉中未检测到EGF活性或含量较低（0.41～0.62 ng/mL）。 Xiao等[23]研究表明新鲜牛奶的EGF含量为13.8～18.2 nmol/L，与足月儿奶相当，配方奶的EGF浓度明显低于人奶和新鲜牛奶。但将牛初乳加工成产品后，其EGF含量迄今未见报道。该研究结果表明，初乳素的EGF含量为5 ng/g，2种牛初乳保健食品的EGF含量为2～3 ng/g，远高于LM和市售奶粉。由此可见，牛初乳产品比常乳及乳制品有更高的EGF含量。
　　不同的加工方式对牛初乳中生长因子的含量会产生影响，如羊乳在高温短时巴氏杀菌（75 ℃15 s，85 ℃10 s）时其EGF浓度较为稳定，保留率在90%以上，而在低温长时巴氏杀菌（63 ℃30 min）和超高温瞬时杀菌（137 ℃2 s）EGF浓度显著降低[24]。EGF、TGF-α和IGF-1的分子量为6～7 ku，如采用超滤浓缩工艺会造成这些生长因子25%以上的损失[15]。初乳素是以奶牛分娩3 d以内的初乳为原料，采用冷冻干燥工艺和冷杀菌技术加工而成，完全保留了牛初乳中的这些具有生理功能的生长因子。
　　免疫球蛋白是牛初乳产品的标志性成分，在第1天的牛初乳中含量最高，在7 d内含量迅速下降，与该研究中测定的几种生长因子在牛初乳中含量的动态变化基本一致，在牛初乳中免疫球蛋白G含量与一些生长因子水平的变化有相关性[3]。初乳素的免疫球蛋白含量≥20%，高于其他2种产品（17%左右），提示初乳素含有更为丰富的生长因子，这可能是初乳素中的生长因子含量高于其他牛初乳产品的原因之一。
　　3 结论
　　该研究首次报道了0～7 d牛初乳经冻干后制成的LBC中EGF、TGF-α和IGF-1含量的动态变化。研究发现，
　　在分娩0～7 d 的LBC中EGF、TGF-α和IGF-1的含量呈下降趋势，第7天的LBC已接近LM水平。48 h内牛初乳冻干后平均干物质含量为200 g/mL。
　　在0～7 d的LBC中这些生长因子含量变化较大，在第1天的LBC中EGF、TGF-α和IGF-1含量最高，分别为7.0 ng/g、16.8 ng/g和3.4 μg/g，第1～4天LBC中EGF的平均含量为LM的7.0倍，TGF-α平均含量是LM的13.7倍，IGF-1含量是LM的6.1倍，提示4 d以内的牛初乳冻干粉有较高含量的生长因子，为牛初乳产品的进一步开发应用提供了依据。
　　3种市售牛初乳保健食品中的EGF和TGF-α含量显著高于LM和2种市售奶粉，初乳素的EGF和TGF-α含量分别为5.6和11.8 ng/g，显著高于其他2种牛初乳保健食品。初乳素的IGF-1含量达到μg/g级水平。
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