脂蛋白脂酶及比较识别基因-58在子痫前期胎盘中的表达及其相关性

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　　摘要 目的：通过检测胎盘中脂蛋白脂酶（LPL）与比较识别基因-58（CGI-58）的表达，探讨LPL、CGI-58与子痫前期的关系及其两项指标的相关性。方法：选取2018年9月至2019年7月在我院分娩的子痫前期患者36例为病例组，以同期分娩的正常孕妇40例为对照组。全自动生化分析仪检测患者分娩前1周内的血脂水平。运用RT-PCR技术检测胎盤中LPL、CGI-58mRNA的相对表达量。Western blotting法检测胎盘中LPL、CGI-58蛋白的表达水平，并分析两者的相关性。结果：①子痫前期胎盘组织中LPLmRNA的相对表达量低于对照组（t=8.431，P<0.05），CGI-58mRNA的相对表达量较对照组下降（t=6.297，P<0.05）。②LPL蛋白在子痫前期胎盘中的浓度为0.45±0.04，低于对照组的0.74±0.10，差异有统计学意义（t=4.815，P<0.05）。CGI-58蛋白在子痫前期胎盘中浓度为0.63±0.19，低于对照组的0.87±0.12，差异有统计学意义（t=2.837，P<0.05）。③LPL蛋白与CGI-58蛋白的相关表达量呈正相关（r=0.602，P=<0.05）。④子痫前期患者血脂中甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B、动脉粥样硬化指数较对照组升高，高密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白A较对照组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：子痫前期孕妇LPL及CGI-58表达水平降低，二者之间的表达水平存在相关性。
　　中图分类号  R714.244    文献标识码  A    文章编号  1671-0223（2020）06-033-04
　　子痫前期是一种妊娠期特发性疾病，其发病率约为3%-6%，目前仍然是全球孕产妇及胎儿发病率和死亡率的主要原因[1]。子痫前期在发展中国家的发病率约为发达国家的7倍，给我国医疗卫生带来巨大挑战[2]。目前认为子痫前期是一种多因素、多机制及多通路致病的疾病，其中胎盘病变被认为是其发病的中心环节。甘油三酯脂肪酶基因家族中的脂蛋白脂酶（1ipoprotein lipase，LPL）及比较识别基因-58（CGI-58）通过脂质水解作用，在血浆及胎盘中转运脂蛋白及游离脂肪酸，对维持正常脂质代谢十分重要。本研究通过检测LPL和CGI-58在子痫前期产妇胎盘组织中的表达，探讨LPL、CGI-58在血脂代谢异常及子痫前期发病中的可能作用。
　　1对象与方法
　　1.1研究对象 选择2018年9月至2019年7月在华北理工大学附属医院住院分娩的子痫前期孕妇37例为病例组，以同期无妊娠并发症和合并症的健康孕妇40例为对照组。所有孕妇的孕周均在37～41周，单胎剖宫产分娩，无烟酒、吸毒不良嗜好，排除合并糖尿病、慢性高血压、心脏病、严重肝肾疾病，自身免疫性疾病，其他内分泌疾病、血液性疾病、胎膜早破和近期感染病史。子痫前期的诊断标准依据谢幸主编的《妇产科学》第9版。
　　1.2标本采集 入院后采集次日空腹肘静脉血3mL，离心后检测血清中的血脂浓度。在胎盘娩出30分钟以内，严格无菌条件下，于胎盘母体面处随机取1份组织，大小约1×1×1cm，注意避开栓塞及钙化部位。将胎盘组织放入灭菌的冻存管中，于液氮中保存，用于RT-PCR及Western blotting检测。
　　1.3主要试剂 兔抗人LPL单克隆抗体购自美国Affinity Biosciences公司;兔抗人CGI-58单克隆抗体购自武汉ABclonal公司;内参β-actin购自美国proteintech公司;蛋白裂解液购自上海碧云天生物技术公司。
　　1.4检测方法
　　1.4.1血脂浓度检测
　　由专业检验员采用迈瑞420型全自动生化分析仪完成。检测项目包括甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、载脂蛋白A（ApoA）、载脂蛋白B（ApoB）浓度。
　　1.4.2 RT-PCR法检测胎盘组织LPLmRNA和CGI-58mRNA表达
　　从-80℃液氮罐中取出胎盘组织，称重后置于液氮预冷的研钵中进行研磨，并不断加入液氮，直至研磨成粉末状，加入Trizol裂解液后提取总RNA，用紫外分光光度计测量样品纯度及浓度。按照试剂盒说明书将RNA转录为cDNA，并以此为模板进行PCR扩增。以肌动蛋白（β-actin）为内参照，引物序列：For：5′-ATATGAGATGCGTTGTTA-3′，Rev：5′-AAGTATTAAGGCGAAGAT-3′。LPL基因引物序列：For：5′-CATAGCCTATAATTGGTTAG-3′，Rev：5′-GTGTAGATGAGTCTGATT-3′。CGI-58基因引物序列：For：5′-ATCAAGGGTTAATCATCTCA-3′，Rev：5′-CTGGAATTGGTCTGTCTT-3′。PCR反应过程：95℃10min，95℃15s，60℃20s×40循环，72℃30s，60℃1min。采用2-ΔΔCT法计算两组中CGI-58mRNA、LPLmRNA的相对表达量，以β-actin为内参，ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值，ΔΔCt=病例组ΔCt值-对照组ΔCt值，设对照组2-ΔΔCT值为1，计算病例组mRNA的相对表达量。
　　1.4.3 Western blotting法检测胎盘组织LPL和CGI-58蛋白的表达
　　将50mg胎盘组织在液氮中研磨至粉末状，与RIPA蛋白裂解液混匀，冰盒中保存30min，4℃，2000g的条件下离心15min，收集溶解组织蛋白的上清液用于Western blotting检测。用Bradford法测定蛋白浓度。上样15μg蛋白样品，10%聚丙烯酰胺凝胶行SDS-PAGE电泳，用聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride PVDF）分离蛋白。在PVDF膜上加入兔抗人LPL单克隆抗体（1∶1000）/兔抗人CGI-58单克隆抗体（1∶1000），4℃过夜，TBST缓冲液洗膜3次。加入羊抗兔IgG二抗（1∶3000），室温孵育2h，TBST缓冲液洗膜3次。滴加ECL化学显色剂，在暗室进行曝光显影。检测各条带的光密度值，计算目的蛋白与内参蛋白的比值，作为目的蛋白的相对表达量。 　　1.5统计学分析
　　运用SPSS17.0软件包进行统计分析，正态分布的计量资料以“均数±标准差”的形式表示，两组间均数比较采用独立样本t检验，两个变量之间的相关性采用直线相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1两组孕产妇血脂浓度的比较
　　 病例組患者血清中的的TG浓度、LDL-C、ApoB较对照组升高，HDL-C、ApoA浓度较对照组降低，差异有统计学意义（P<0.01）。两组之间TC浓度及脂蛋白a（Lp（a））水平差异无统计学意义（P >0.05）。动脉粥样硬化指数[AI=（TC-HDL-C）/HDL-C]可直接反应脂代谢紊乱程度，是预测动脉粥样硬化的一种指标，病例组AI指数高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　2.2两组孕产妇胎盘组织中LPLmRNA和CGI-58mRNA表达的比较
　　病例组胎盘组织中LPLmRNA相对表达量，CGI-58mRNA的相对表达量均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
　　2.3两组孕产妇胎盘组织中LPL和CGI-58蛋白的表达
　　Western blotting印迹结果显示，LPL蛋白及CGI-58蛋白在病例组胎盘中的浓度均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。LPL蛋白与CGI-58蛋白的相关表达量呈正相关（r=0.602， P<0.05）。
　　3.1母体血脂水平与子痫前期
　　子痫前期发病与脂代谢异常有关，患者的血脂水平可出现动脉粥样硬化样改变[3-4]。本研究中发现，TG、LDL-C及ApoB具有血管损伤作用，其浓度在子痫前期中升高，血管保护性HDL-C及ApoA浓度较对照组降低，AI可反映动脉粥样硬化的程度，是危险因素与保护因素的比值，在子痫前期中比值升高。 Wojcik-Baszk等人研究表明子痫前期孕妇血脂中总胆固醇浓度>205mg/dL、TG浓度>133mg/dL，分别较正常孕妇升高4.16倍、3.6倍，LDL浓度升高10.4%，HDL浓度降低7%，与本研究一致。子痫前期中存在脂质代谢紊乱，可产生大量过氧化物，释放活性氧物质引起氧化应激反应，进一步造成血管舒张功能减低及内皮损伤，与子痫前期发病有关。
　　TG浓度升高是子痫前期的重要标志，Wojcik-Baszko等人发现子痫前期患者的TG浓度较正常孕妇升高幅度更大，高甘油三脂血症可使子痫前期发病风险升高4倍[5]。目前认为LDL主要以氧化修饰低密度脂蛋白（OX-LDL）的形式参与动脉粥样硬化性心脑血管疾病的发病环节，高OX-LDL可使子痫前期的发病风险增加了1.7倍[6]。OX-LDL可产生大量活性氧，引起氧化应激，使泡沫细胞在血管内皮聚集，同时抑制内皮细胞和血小板合成前列环素，促进血栓素的形成，引起血管收缩及内皮损伤[7]。HDL参与脂质代谢过程，使血清CM、VLDL浓度降低，阻碍胆固醇在血管壁和其他组织中的聚集，有助于清除脂质，对血管起到保护作用[8]。在子痫前期中，低水平的HDL-2-C和高水平的TG影响血管功能，使前列环素/血栓素比例下降，使血管紧张素-2的敏感性增加，血压增高，导致一系列病理变化[9]。高胆固醇血脂，与子痫前期血脂无明显相关性，虽在FH杂合子女性未见早产或低出生体重高风险，且FH病例中子痫前期、子痫或妊娠期高血压的患病率无显著增高，但FH纯合子女性的妊娠大多是致命性的，且急性冠状动脉事件发生率较高[10]。载脂蛋白是血浆脂蛋白中的蛋白质部分，能够结合和运输血脂到机体各组织进行代谢及利用。ApoE促进子痫过脂代谢异常前期发生的机制尚不明确，可能通过脂代谢异常和炎症、凋亡反应，并与一氧化氮合酶共同作用影响子痫前期发病[11]。
　　所以我们推测参与脂质代谢的关键性物质可能在子痫前期的发病中起一定作用
　　3.2 LPL、CGI-58在子痫前期胎盘中的表达及意义
　　胎盘脂质转运是胎儿重要的供能方式，母体TG必须通过胎盘TG分解为游离脂肪酸进入胎盘，胎儿体内20%-50%的脂肪酸来自母体循环[12]。LPL是TG脂肪酶家族成员之一，主要的生理功能是水解乳糜微粒（CM）和极低密度脂蛋白（VLDL）颗粒内的TG，使之转变为小分子脂肪酸、载脂蛋白和磷脂，提供组织氧化及供能[13]。CGI-58主要表达在脂肪细胞的脂滴中，可作为激动蛋白参与TG脂肪酶的水解过程，使其催化效率提升20倍[14]。CGI-58与LPL共同参与TG的水解过程，其表达异常可造成胎盘脂质转运障碍，造成脂质过氧化物堆积，引起血管内皮损伤，影响胎盘的脂质代谢及能量供应。
　　子痫前期孕妇血脂、脂蛋白代谢存在明显异常。胎盘组织化学研究表明子痫前期时胎盘梗死，胎盘中LPL酶活性明显下降，导致营养物质转换能力下降，影响胎儿生长发育。张春利等利用RT-PCR方法发现子痫前期组LPLmRNA表达水平显著低于正常组，认为子痫前期胎盘合成LPL的功能降低，促使血TG水平升高，导致或加重了血管内皮损伤，LDL廓清率下降，促使动脉粥样硬化发生，子痫前期形成或加重[15]。Aung等[16]发现，富含TG的脂蛋白引起脂解产物累积时，可激活激活转录因子3（activated transcriptional factor3，ATF3），并与下游炎症分子结合（IL-1、IL-8、E选择素、VEGF等），继而促发内皮细胞炎症与凋亡。一项针对子痫前期基因变异的Meta分析发现，LPLrs268的G等位基因与LPL活性降低和血脂异常有关，由于血脂异常可导致内皮细胞功能障碍，G等位基因携带者可能增加发生子痫前期的风险。LPL等位基因携带者患冠心病的风险增加，LPL的rs268变异与不良脂质分布相关。遗传变异的存在可能导致有先兆子痫病史的妇女患心血管疾病的风险增加[17]。本研究中子痫前期胎盘组织CGI-58、LPL表达下降（P<0.05），推测胎盘组织低表达CGI-58、LPL不仅影响全身脂质代谢水平，还与母胎界面的营养输送有关，低表达CGI-58、LPL可能影响胎盘浅着床、胎盘血管化，最终导致滋养层细胞浸润不足导致子痫前期发生。 　　4参考文献
　　[1] Dymara-Konopka W，Laskowska M，B?a?ewicz A，et al.Angiogenic imbalance as a contributor of preeclampsia[J].Current Pharmaceutical Biotechnology，2018，19（10）：787-815.
　　[2] Malik A，Jee B，Gupta S K，et al.Preeclampsia：Disease biology and burden，its management strategies with reference to India[J].Pregnancy Hypertens，2019，81（15）：23-31.
　　[3] Kaaja，Risto.Lipid abnormalities in pre-eclampsia：implications for vascular health[J].Clinical Lipidology，2011，6（1）：71-78.
　　[4] Charlton F，Tooher J，Rye K A，et al.Cardiovascular risk，lipids and pregnancy：preeclampsia and the risk of later life cardiovascular disease[J].Heart，Lung and Circulation，2013，23（3）：203-212.
　　[5] Wojcik-Baszko D，Charkiewicz K，Laudanski P.Role of dyslipidemia in preeclampsia-A review of lipidomic analysis of blood，placenta，syncytiotrophoblast microvesicles and umbilical cord artery from women with preeclampsia[J].Prostaglandins Other Lipid Mediat，2018，139（10）：19-23.
　　[6] Viall C A，Chen Q，Liu B，et al.Antiphospholipid antibodies internalised by human syncytiotrophoblast cause aberrant cell death and the release of necrotic trophoblast debris[J].J Autoimmun，2013，47（1）：45-57.
　　[7] Stepan H，Kley K，Hindricks J，et al.Serum levels of the adipokine fibroblast growth factor-21 are increased in preeclampsia[J].Cytokine，2013，62（2）：322-326.
　　[8] Amiri M，Ramezani T F，Rahmati M，et al.Changes over-time in blood pressure of women with preeclampsia compared to those with normotensive pregnancies：A 15year population-based cohort study[J].Pregnancy Hypertens，2019，17（1）：94-99.
　　[9] Vangrieken P，Al-Nasiry S，Janssen G，et al.The direct and sustained consequences of severe placental hypoxia on vascular contractility[J].PLoS One，2018，13（8）：202-209.
　　[10] Toleikyte I，Retterstol K，Leren T P，et al.Pregnancy outcomes in familial hypercholester-olemia：a registry-based study[J].Circu?lation，2011，124（15）：1606-1614.
　　[11] Zhou L，Hui X，Yuan H，et al.Combination of genetic markers and age effectively facilitates the identification of people with high risk of preeclampsia in the Han Chinese Population[J].Biomed Res Int，2018，32（6）：437-442.
　　[12] Hirschmugl B，Desoye G，Catalano P，et al.Maternal obesity modulates intracellular lipid turn-over in the human term placenta[J].International Journal of Obesity，2016，41（2）：317-323.
　　[13]陈圆圆，程蔚蔚.甘油三酯脂肪酶异常与子痫前期的相关性[J].现代妇产科进展，2017，26（05）：399-400.
　　[14] Kulminskaya N，Oberer M.Protein-protein interactions regulate the activity of Adipose Triglyceride Lipase in intracellular lipolysis[J].Biochimie，2020，16（9）：62-68.
　　[15] 张春利，李东红，尹国武，等.脂蛋白脂酶基因在子痫前期胎盘中的变化及意义[J].中国优生与遗传杂志，2006，14（4）：23-24.
　　[16] Aung H H，Lame M W，Gohil K，et al.Induction of ATF3 gene network by triglyceride-rich lipoprotein lipolysis products in-creases vascularapoptosis and inflammation[J].Arterioscler Thromb Vasc-Biol，2013，33（9）：2088-2096.
　　[17] Buurma A J，Turner R J，Driessen J H，et al.Genetic variants in pre-eclampsia：a meta-analysis[J].Human Reproduction Update，2013，19（3）：289-303.
　　[2020-03-26收稿]
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