釉基质蛋白衍生物对人牙周膜干细胞分化、增殖的影响观察

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　　【摘要】 目的 分析研究釉基质蛋白衍生物对人牙周膜干细胞分化及其增殖的影响。方法 3例健康的因正畸原因拔除前磨牙及2例埋伏第三恒牙患者， 对人牙周膜干细胞进行分离培养， 检验分析表面抗原表达及其克隆形成率， 对其多向分化潜能进行鉴定， 分析在牙周膜干细胞上进行不同质量浓度的釉基质衍生物培养2周和4周， 依据 Von Kosa’s和Trichrome 染色法对牙周膜干细胞矿化结节形成和胶原合成情况进行分析， 依据Real time 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） 法对成骨分化相关基因Ⅰ型胶原、RUX2及其骨钙素表达情况进行检测， 分析在牙周膜干细胞增殖情况检测中3-（4， 5-二甲基噻唑-2）-2， 5-二苯基四氮唑溴盐（MTT） 法与生长率法的作用。结果 相比牙周膜细胞克隆形成率0.42%、STRO-1-细胞克隆形成率0.21%， STRO-1+细胞（牙周膜干细胞）克隆形成率1.42%更高。表面抗原CD105表达率99.8%、CD29表达率99.7%、CD45表达率1.26%、CD44表达率98.8%。结论 釉基质衍生物在试验中显示为一定时间剂量效应关系， 利于牙周膜干细胞胶原合成， 形成矿化结节， 促使有效表达骨分化相关基因Ⅰ型胶原、RUX2及其骨钙素， 对于牙周膜干细胞增殖十分有利， 具有再生和修复牙周组织的临床作用。
　　【关键词】 釉基质蛋白衍生物;人牙周膜干细胞;分化;增殖
　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.11.086
　　牙周膜干細胞实际上是在牙周膜内存在的成体干细胞， 存在牙周再生能力和多向分化潜力， 在牙周组织中釉基质衍生物能够再生， 可对细胞增殖、定向分化作用进行刺激[1]。釉基质衍生物实际上是取自于发育期牙釉组织的一种物质， 釉质蛋白为主要成分， 虽然釉基质衍生物可对牙槽骨修复具有一定促进作用， 但还是存在不明确的机制。本文阐述了2018年1月～2019年1月3例健康的因正畸原因拔除的前磨牙及其2例埋伏第三恒牙的实验效果。现报告如下。
　　1 资料与方法
　　1. 1 一般资料 本文选取2018年1月～2019年1月3例健康的因正畸原因拔除前磨牙及2例埋伏第三恒牙患者作为研究对象， 患者及其家属表示对医院给出的知情同意书签字认可， 移交医学伦理会得到批准。
　　1. 2 方法
　　1. 2. 1 牙周膜细胞分离培养 基于无菌环境下将离体牙牙根中1/3位置牙周膜进行小心分离， 在37℃下使用4 g/L胰蛋白酶和3 g/LⅠ型胶原酶进行1 h消化， 在10 cm培养皿上接种， 加入DMEM培养基， 主要涵盖10%胎牛血清、100 g/ml链霉素、100 U/ml青霉素G， 基于37℃在5% CO2培养箱内进行培养。
　　1. 2. 2 FACS分选 经5～7 d培养上述牙周膜细胞后， 通过Tryple E消化细胞， 在blocking buffer中重悬细胞， 放置在0℃环境内20 min， 使用2 mg/L、STRO-1免疫球蛋白M（IgM）抗体进行1 h孵育;通过流式细胞仪对STRO-1+细胞进行分选， 实施细胞传代培养， 使用第2代或3代细胞展开相关实验。
　　1. 2. 3 克隆形成率测定 在5 cm培养皿中接种400个牙周膜细胞、400个STRO-1-细胞、400个STRO-1+细胞， 在标准培养液中进行14 d的培养， 使用10%甲醛溶液固定后1% violet blue染色。1个克隆即为>50个细胞聚成的细胞集落。克隆形成率=每个培养皿中的克隆数/植入细胞数。
　　1. 2. 4 流式细胞仪表面抗原检测 用Tryple E 消化第3代牙周膜干细胞后， 在 blocking buffer 中重悬细胞， 放置在0℃环境内20 min， 实施EP管分装处理， 每管100 μl， 分别将CD105、CD44、CD34、CD45抗体加入1 μl进行1 h孵育， 重悬后将二抗加入再次控模型重悬， 通过流式细胞仪实施相关指标的检测。
　　1. 2. 5 多向分化能力检测 以5×107个/L细胞浓度将第2代牙周膜干细胞加入24孔板内进行24 h孵育， 更换培养液为成骨诱导液、成软骨诱导液、成脂诱导液， 间隔3 d更换1次， 21 d后采用von kosa染色法对成骨诱导组培养板内矿化结节形成状态进行观察， 使用番红O染色法对软骨形成状态进行观察， 使用油红O染色法对脂滴形成状态进行观察。
　　1. 2. 6 成骨分化相关指标检测 分组培养第3代牙周膜干细胞， 将不同质量浓度的釉基质衍生物加入到相同的培养液中， 分别为20 mg/L釉基质衍生物、50 mg/L釉基质衍生物、100 mg/L釉基质衍生物， 放置到37℃环境下， 在5% CO2培养箱中进行2周及4周的培养。通过Trichrome染色法对胶原合成情况进行检测：依据试剂相关说明书实施操作， 以10%甲醛溶液固定细胞后， 将Bouin's溶液加入后放置于56 ℃环境下1 h， 将Weigert铁苏木精染液放入10 min， 之后进行清洗， 加入比布列西酸性品红液大约10～15 min后， 再加入苯胺蓝溶液， 大约10 min后使用1%乙酸进行5 min清洗， 脱水后进行镜下观察。通过Von Kosa’s 染色法对矿化结节形成状态进行检测， 依据VonKosa’s染色法能够把矿化结节染成黑色， 在对细胞爬片固定且PBS洗涤后， 置入到5%硝酸银水溶液内10 min， 并且在日光下进行20 min曝晒后通过蒸馏水进行洗涤， 同时进行乙醇系列脱水， 二甲苯显示为透明。通过RT-PCR法对成骨相关基因表达进行检测， 进行2周及4周培养过程中收集细胞， 依据TRIzol法对总RNA进行抽提， 实施反转录后形成cDNA， 并且将其当做模板， 通过目标基因的引物开展Real time RT-PCR， 对目标基因的表达进行检测。通过MTT法对细胞增殖情况进行检测， 以每孔4×104个的浓度将第3代牙周膜干细胞种入到96孔板， 将不同浓度的釉基质衍生物加入进行48 h孵育， 以含5 g/L MTT PBS取代培养液， 基于37℃环境下使用5% CO2进行48 h孵育， 读取570 nm波长处的吸光度值。细胞生长率：以每孔5 000个的密度种将第3代牙周膜干细胞置入到12孔培养板上进行24 h培养， 在无血清DMEM中进行24 h再培养， 在存在100 mg/L釉基质衍生物的培养基中进行2 d与4 d的再培养， 分析消化细胞后计数情况。 　　2 结果
　　2. 1 克隆形成率、细胞形态学 试验研究显示， 对细胞进行低密度接种后， 基于光镜下进行观察显示出克隆样生长。经14 d培养后， 相比牙周膜细胞克隆形成率0.42%、STRO-1-细胞克隆形成率0.21%， STRO-1+细胞（牙周膜干细胞）克隆形成率1.42%更高。
　　2. 2 牙周膜干细胞表面抗原表达情况 CD105表达率99.8%、CD29表达率99.7%、CD44表达率98.8%、CD45表达率1.26%， 证实， 牙周膜干细胞属于间充质来源的干细胞。
　　2. 3 牙周膜干细胞多向分化能力情况 诱导分化牙周膜干细胞成骨后， 经Von Kosa染色处理显示矿化结节;经成脂诱导培养后， 油红O染色显示脂滴;经过成软骨诱导培养后番红花精O染色显示为阳性， 表示牙周膜干细胞存在多向分化潜能。
　　2. 4 釉基质衍生物对牙周膜干细胞成骨分化影响作用 胶原合成能力：通过Trichrome染色法对不同质量浓度的釉基质衍生物进行检验， 分别是0、20、50、100 mg/L， 试验研究显示， 釉基质衍生物可对牙周膜干细胞胶原合成进行促进， 且显示为剂量效应关系;100 mg/L剂量具有最强的牙周膜干细胞分化促进作用。随着试验时间的增加延长， 釉基质衍生物不断增加促进牙周膜干细胞胶原合成的临床作用， 證实上述操作存在时间效应关系。
　　矿化能力：在牙周膜干细胞上以0、100 mg/L釉基质衍生物进行2、4周作用， 随着时间的增加， 可显著提升釉基质衍生物对于牙周膜干细胞矿化结节形成的促进作用。
　　成骨相关基因表达：在牙周膜干细胞上以0、100 mg/L釉基质衍生物进行2、4周作用， 通过Real time RT-PCR法对成骨基因Ⅰ型胶原、Runχ2表达及其骨钙素进行表示， Runχ2表达：2周0 mg/L为1.53、100 mg/L为8.69， 4周0 mg/L为1.55、100 mg/L为6.58;Ⅰ型胶原表达：2周0 mg/L为1.11、100 mg/L为3.53， 4周0 mg/L为1.32、100 mg/L为6.53;骨钙素：2周0 mg/L为1.66、100 mg/L为5.39， 4周0 mg/L为1.68、100 mg/L为7.99。证实， 随着时间的增加， 可显著提升釉基质衍生物对于牙周膜干细胞向成骨细胞分化的促进作用。
　　釉基质衍生物可将牙周膜干细胞活力增强， 随着不断增加质量浓度， 会增加促进作用， 0 mg/L为1.01， 20 mg/L为1.61， 50 mg/L为1.83， 100 mg/L为1.95;通过100 mg/L剂量实施细胞生长试验， 表明随着时间的增加， 明显增加牙周膜干细胞数， 即为0 d为0.5×105， 2 d为1.5×105， 4 d为3.5×105。
　　3 讨论
　　现阶段临床治疗牙周炎疾病过程中促进组织修复、控制局部炎症为主要方法。针对牙槽骨缺损患者最理想的临床治疗方法为牙槽骨再生， 但牙槽骨再生始终都是治疗牙周炎疾病的重点和难点[2]。此外， 牙槽骨缺损和吸收引发的骨量不足， 也属于种植牙治疗的主要问题， 因具有不足够的骨量， 导致种植体固位不良， 患者可能需要选择移骨粉或者植自体骨等材料对骨量进行增加， 导致容易种植修复失败或者放弃治疗。如可将牙槽骨再生水平显著提升， 能够有效处理骨量不足导致的问题， 促使种植修复效果比较满意[3-5]。现阶段在治疗牙周病和修复牙周缺损过程中牙周骨移植及其引导组织再生术属于常见方法， 但具有不理想的牙周组织生理功能和结构恢复效果。釉基质衍生物是取自发育期牙釉组织的一种物质， 釉基质衍生物利于牙周膜干细胞成骨对基因Ⅰ型胶原、RUχ2及其骨钙素的分化[6-8]。
　　综上所述， 釉基质蛋白能促进牙周膜细胞增殖、蛋白合成及矿化相关蛋白骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达。
　　参考文献
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　　[收稿日期：2019-09-12]
　　基金项目：十堰市市级引导性科研项目（项目编号：17Y43）
　　作者单位：442000 湖北医药学院附属口腔医院
　　通讯作者：任伟伟
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