GNB2L1对恶性黑素瘤细胞增殖和迁移的影响

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　　[摘要]目的：探讨支架蛋白重组人鸟嘌呤核苷酸结合蛋白beta多肽2样蛋白1（guanine nucleotide-binding protein subunit Beta 2-like 1，GNB2L1）对小鼠恶性黑素瘤B16F10细胞增殖和迁移的影响。方法：用靶向GNB2Ll的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒液和空载体慢病毒液感染恶性黑素瘤B16F10细胞，分别获得稳定感染细胞株B16F10-GNB2L1-shRNA（阳性实验组）和B16F10-NC（阴性对照组），未感染病毒液的细胞株B16F10设为空白对照组。Western blot检测GNB2Ll以及上皮间质转化标志蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）的表达水平;CCK-8检测细胞的增殖能力;划痕实验检测细胞的迁移能力。结果：与B16F10和B16F10-NC相比，B16F10-GNB2L1-shRNA中GNB2Ll蛋白表达水平明显下调;GNB2L1敲降可明显抑制B16F10细胞的增殖和划痕迁移能力;Western blot特异性抗体检测发现GNB2L1敲降的细胞中N-cadherin的蛋白表达水平明显降低，而E-cadherin的蛋白表达水平明显升高。结论：下调GNB2Ll蛋白表达可有效抑制恶性黑素瘤B16F10细胞的增殖和迁移能力。
　　[关键词]GNB2Ll;恶性黑素瘤;shRNA;上皮间质转化;增殖;迁移
　　[中图分类号]R739.5    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）06-0059-05
　　Abstract： Objective  To investigate the effect of scaffold protein Guanine nucleotide-binding protein subunit Beta 2-like 1 （GNB2L1） on proliferation and migration of mouse malignant melanoma B16F10 cells. Methods  Malignant melanoma B16F10 cells were infected with short hairpin RNA （shRNA） lentiviral solution and empty vector lentiviral solution targeting GNB2L1 to obtain stable infected cell line B16F10-GNB2L1-shRNA （positive experimental group） and B16F10-NC （negative control group）， cell line B16F10 not infected with virus solution was set as a blank control group. Western blot was used to detect the expression levels of GNB2L1 and epithelial-mesenchymal transition marker proteins E-cadherin and N-cadherin; CCK-8 was used to detect the cells proliferation ability; scratch test was used to detect cells migration ability. Results  Compared with B16F10 and B16F10-NC， the expression of GNB2L1 protein was down-regulated in B16F10-GNB2L1-shRNA; GNB2L1 knockdown significantly inhibited the proliferation and scratch migration ability of B16F10 cells; Western blot specific antibody detection found that GNB2L1 knockdown the expression level of N-cadherin protein was significantly decreased in cells， while the expression level of E-cadherin protein was significantly increased. Conclusion  Down-regulation of GNB2L1 protein expression can effectively inhibit the proliferation and migration of malignant melanoma B16F10 cells.
　　Key words： GNB2Ll; malignant melanoma; shRNA; EMT; proliferation; migration
　　惡性黑素瘤（malignant melanoma，MM）是一种来源于黑素细胞的侵袭性皮肤恶性肿瘤，尽管其发病率仅占所有皮肤病的4%，却占皮肤肿瘤相关死亡疾病的90%，是皮肤癌相关死亡的最主要原因[1]，发病率和死亡率呈逐年上升趋势。2018年最新癌症统计数据显示美国皮肤恶性黑素瘤新增病例91 270例[2]，相比2017年癌症统计[3]显示的恶性黑素瘤新增病例87 110例要高。而且恶性黑素瘤在我国发病率近年来成倍增长，每年新发病例约2万人[4]，已经成为严重危及我国人民健康的疾病之一。 　　GNB2L1又称激活的蛋白激酶C受体1（receptor for Activated C Kinase l，RACKl），是一种36KDa的蛋白质，属于色氨酸-天冬氨酸重复序列（tryptophan-aspartate repeat，WD-repeat）β-螺旋桨蛋白家族成员，含有7个WD-40的重复序列，高度保守地存在于哺乳动物和人类的肝、脑和脾等组织中。GNB2L1属于支架蛋白，被认为是多种功能信号通路的枢纽，提供蛋白质-蛋白质相互作用的平台，并在细胞的生长、黏附、增殖、侵袭和迁移等过程中发挥重要的作用。目前已有研究表明GNB2L1在多种肿瘤细胞中表达上调，包括乳腺癌[5]、非小细胞肺癌[6]、結肠癌[7]、脑胶质瘤[8]和胰腺导管腺癌[9]等，被认为不良预后的因素。由此可见，GNB2L1在肿瘤细胞的产生、增殖、分化、恶变、侵袭和迁移等方面发挥着关键的调节作用。因此，笔者推测GNB2L1支架蛋白可能参与了恶性黑素瘤的发生与发展过程，对恶性黑素瘤的增殖和迁移等生物学行为发挥了重要的调控作用。
　　1  材料和方法
　　1.1 主要试剂与仪器：DMEM细胞培养基、胎牛血清、PBS缓冲液及0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美国）;GNB2L1 shRNA和NC shRNA（金维智生物科技有限公司，中国）;Lipofectamine2 000 （Invitrogen公司，美国） ;兔RACK1单克隆抗体、兔N-cadeherin 多克隆抗体和鼠E-cadeherin 单克隆抗体（Abcam公司，美国）;鼠β-actin单克隆抗体、鼠GAPDH单克隆抗体、增强型CCK-8试剂盒（上海Beyotime生物技术有限公司，中国）;HRP标记山羊抗兔IgG和抗鼠IgG抗体（Cell Signaling公司，美国）;RIPA细胞裂解液（北京索莱宝技术有限公司，中国）;BCA法蛋白浓度检测试剂盒（Thermo公司，美国）;基本型ECL发光底物A液、B液（上海圣尔生物科技有限公司，中国）;质粒中抽试剂盒（天根生化科技北京有限公司，中国）;NcmDH5α感受态细胞（新赛美生物科技有限公司，中国）;CO2恒温培养箱（Haier公司，中国）;Mini-P TET蛋白电泳系统、凝胶成像系统GelDoc XR+ （Bio-Rad公司，美国）;电泳转移槽（上海Tanon有限公司，中国）;多功能酶标仪Infinite M200 Pro（Tecan公司，瑞士）。
　　1.2 细胞培养：恶性黑素瘤B16F10细胞源自上海复旦大学生命科学院重点实验室，用含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基在37℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养，隔天换液1次。当细胞铺满培养瓶底壁面积的80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。
　　1.3 GNB2L1干扰寡核苷酸序列的合成和慢病毒包装：将针对GNB2L1干扰靶点的shRNA序列克隆到慢病毒表达载体质粒上，正义链：5'-CACCGAGATAAGACCATCATCATGTTTCAAGAGAACATGATGATGGTCTTATCTCTTTTTTG-3'，反义链：5'-AGCTCAAAAAAGAGATAAGACCATCATCATGTTCTCTTGAAACATGATGATGGTCTTATCTC-3'。293T细胞接种于6cm培养皿中，将病毒包装质粒和核心质粒与Lipofectamine 2 000脂质体混合，质粒质量：脂质体体积比为1：2，加入适量的无血清的OPTI培养基，轻轻晃动培养皿使其充分混匀，置于37℃、CO2恒温培养箱孵育，6～8h后更换含有血清的新鲜完全培养基，培养48h后收集上清液。
　　1.4 慢病毒转染细胞：B16F10细胞接种于6孔板，置于37℃、5% CO2恒温培养箱孵育，当细胞贴壁后，所占面积达80%～90%时，吸弃6孔板旧的培养基，加入新收集的病毒液继续感染24h。更换新鲜的完全培养基，加入嘌呤霉素，使其浓度为1.5?g/ml，筛选嘌呤霉素抗性基因表达阳性的细胞，无嘌呤霉素抗性基因的细胞被杀死，每天更换新鲜的含有嘌呤霉素的培养基，以获得转染GNB2L1 shRNA序列的细胞株（B16F10-GNB2L1-shRNA），用于后续实验。
　　1.5 CCK8测量细胞增殖活性：将生长对数期B16F10细胞接种至96孔板，接种浓度1 500个/孔，每孔150?l培养基，每组6个复孔。将96孔板置于37℃、5% CO2恒温培养箱培养24h后，当细胞融合率达80%～90%，每孔加入150?l的CCK-8溶液，继续培养2h，用酶标仪测波长为450nm的OD值。
　　1.6 划痕试验：将B16F10细胞接种于6孔板，每组3个复孔，在6孔板底面的外壁用标记笔划纵向黑线，用黄色枪头在细胞上垂直于纵向黑线划痕，PBS缓冲液冲洗清除划下的细胞，加入无血清的DMEM细胞培养基，在倒置显微镜下拍照，记为0h。将细胞放入37℃、5% CO2培养箱继续培养24～48h，利用倒置显微镜，保持与0h拍照一致的位置，记录24h和48h划痕宽度变化。
　　1.7 Western blot检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）表达水平：RIPA细胞裂解液裂解细胞提取转染GNB2L1 shRNA的蛋白，根据BCA法蛋白浓度检测试剂盒说明书在570nm波长处测量蛋白标准品的OD值，制作蛋白标准品的标准曲线，算出待测蛋白浓度，SDS样品缓冲液（5×）100℃加热5min，使蛋白变性。配胶完成后上样，电泳分离，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，含4%脱脂奶粉的TBST室温下封闭1h，再分别与E-cadherin和N-cadherin一抗（ 稀释比分别为1‥2 000和1‥3 000） 及GAPDH一抗（ 稀释比为1：1 000） 4℃温育过夜。TBST缓冲液洗膜3次，HRP耦联的IgG作为二抗（稀释比为1：10 000）室温温育1h，重复洗膜3次，ECL发光法显色，利用Image Lab软件进行图像分析。 　　1.8 统计学分析：采用Graphpad prism 6软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（x?±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2  结果
　　2.1 GNB2L1 shRNA的B16F10细胞下调GNB2L1支架蛋白的表达：与空白组B16F10和阴性对照组B16F10-NC相比，B16F10细胞稳定转染GNB2L1 shRNA中GNB2L1支架蛋白的条带颜色明显较浅（见图1）。该结果显示B16F10-GNB2L1-shRNA组细胞的GNB2L1表达量明显下降，表明GNB2L1 shRNA转染成功，GNB2L1敲除成功。
　　2.2 穩定转染GNB2L1 shRNA的B16F10细胞增殖活性显著下降：在相同初始接种浓度下和观察时间段内（24～72h），三组的OD值持续增加，48～72h的增加速率高于24～48h增加速度;其中空白组B16F10细胞和阴性对照组B16F10-NC细胞的OD值增加速率接近，都较B16F10-GNB2Ll-shRNA细胞的OD值高;尤其在接种72h后，空白组B16F10细胞的OD值显著高于实验组B16F10-GNB2Ll-shRNA细胞，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;尽管此时阴性对照组B16F10-NC细胞的OD值亦较高，与空白对照组B16F10细胞的OD值相比，两组差异不明显，无统计学意义（P>0.05）（见表1，图2）。该结果证实稳定转染GNB2L1 shRNA的B16F10细胞增殖活性显著下降。
　　2.3 稳定转染GNB2L1 shRNA的B16F10细胞的迁移速度显著减慢：划痕实验显示起始状态下三组的划痕宽度近似，随着时间的推移划痕间距明显减小（见图3）。在24h，B16F10空白组细胞迁移率（82.67±1.4530）和B16F10-NC阴性对照组细胞迁移率（75.00±1.7320）比实验组B16F10-GNB2Ll-shRNA细胞的迁移率（33.00±1.7320）显著增加，两组之间的差异具有统计学意义（P<0.05）;特别在48h，B16F10空白组细胞迁移率（91.67±1.6670）与B16F10-NC阴性对照组细胞迁移率（91.33±2.1860）较实验组B16F10-GNB2Ll-shRNA细胞的迁移率（41.33±1.8560）显著增加，B16F10空白组细胞和B16F10-NC阴性对照组细胞几乎填满整个划痕空隙，两组之间的差异都具有统计学意义（P<0.05）;B16F10空白组细胞迁移率和B16F10-NC阴性对照组细胞迁移率之间无明显差异（P>0.5）（见图4）。该实验结果表明稳定转染GNB2L1shRNA能显著抑制鼠黑素瘤B16F10细胞的迁移运动能力。
　　
　　2.4 稳定转染GNB2L1 shRNA的B16F10细胞中E-cadherin蛋白表达水平：Western blot分析结果发现，B16F10-GNB2L1-shRNA细胞内E-cadherin蛋白的表达量（0.8654±0.0331）明显高于空白对照组B16F10细胞（0.1234±0.0179），差异具有统计学意义（P<0.05）。见图5。
　　2.5 稳定转染GNB2L1 shRNA的B16F10细胞中N-cadherin蛋白表达水平：B16F10-GNB2L1-shRNA细胞内N-cadherin蛋白的表达量（0.01081±0.0007）明显低于空白对照组B16F10细胞（0.2309±0.0295），差异有统计学意义（P<0.05）;而阴性对照组B16F10-NC细胞内N-cadherin细胞的表达量（0.1943±0.0228）与空白对照组B16F10的表达量无统计学差异（P>0.05）。见图6。
　　3  讨论
　　早期发生远处转移是导致大多数黑素瘤患者死亡的主要原因，转移性黑素瘤患者的中位生存时间为8～9个月，3年总体生存率不足15%[10]。转移性黑素瘤是人类第五大最常见并被诊断的癌症[11]之一。恶性黑素瘤的高转移特性一直是其治疗的难点，尽早发现并阻断恶性黑素瘤的转移成为提高患者生存率的关键因素。因此，寻找一种靶向恶性黑素瘤转移的位点对提高患者治疗效果和预后发挥重要作用。
　　肿瘤转移是一个复杂的多步骤过程，涉及到肿瘤细胞与宿主之间的相互作用。肿瘤细胞通过改变自身细胞骨架和细胞外基质结构，黏附、侵袭和转移到周围组织、血管和淋巴管而进入血液循环并向远处组织和器官播散迁移。本实验研究显示下调GNB2L1支架蛋白的表达后，B16F10-GNB2L1-shRNA组与两对照组相比，细胞增殖活性明显受到抑制;划痕实验结果也表明B16F10-GNB2L1-shRNA组的细胞爬满划痕的速率明显低于对照组。根据这些结果推断GNB2L1在促进恶性黑素瘤细胞的增殖和迁移中发挥着重要的作用。
　　上述发现与以往报道中观察到的GNB2L1在其他肿瘤细胞中的作用一致，例如Shen等[12]研究表明GNB2L1在体外和体内均促进前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，通过siRNA对GNB2L1敲低抑制了前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。Peng等[13]研究表明GNB2L1在鼻咽癌组织中高表达，GNB2L1的过表达促进鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移，而下调GNB2L1则抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移。Hu等[14]GNB2L1在食管鳞状细胞癌中上调，GNB2L1的过表达促进食管鳞状细胞癌的增殖和迁移，而GNB2L1的下调在体内和体外均抑制其增殖和迁移。Li等[15]研究表明GNB2L1在口腔鳞状细胞癌中的沉默不仅可抑制细胞的增殖，还可抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移和黏附的能力。
　　上皮细胞-间质转化（EMT）是上皮细胞获得运动迁移能力的一个重要途径，是促使细胞脱离原发病灶的关键步骤。发生EMT改变后不仅可以下调肿瘤细胞连接分子的表达，导致细胞极性缺失，细胞黏附能力下降、运动性提高、侵袭能力增强，还可以通过改变肿瘤生长状态、侵袭和转移以及血管形成的微环境，增强肿瘤侵袭和转移能力[16]。此外，EMT还参与细胞外基质和基底膜溶解，破坏组织之间正常的屏障，进入血液或淋巴循环，在种植部位形成转移瘤[17]。因此，EMT是肿瘤细胞发生侵袭和远处转移的基础。在EMT的过程中通常伴随着E-cadherin上皮细胞标志物表达的下调和N-cadherin等间质表型标志物表达的上调。 　　E-cadherin是一種介导同型细胞-细胞间黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白，在维持上皮细胞形态结构的完整性和极性中发挥重要的作用。在上皮细胞中E-cadherin正常表达，当E-cadherin表达下降时，上皮细胞之间会失去正常极性，发生黏附缺失，从而从上皮表型转变为间质表型，导致肿瘤细胞发生侵袭和转移。因此，E-cadherin也称为恶性肿瘤的侵袭和转移的抑制因子。而N-cadherin与E-cadherin相反。N-cadherin主要在细胞质中高表达，不表达于正常的上皮组织。当上皮组织中N-cadherin表达上调，导致上皮细胞的形态和生物学行为发生改变，促进细胞侵袭和迁移，即发生EMT。大量研究表明在恶性肿瘤中E-cadherin表达的缺失通常伴随着N-cadherin表达的上调，E-cadherin和N-cadherin作为代表性的EMT标志物，与患者不良预后有关，包括胶质瘤[18]、口腔鳞状细胞癌[19]、膀胱移行细胞癌[20]和喉鳞状细胞癌[21]等。本研究通过Western blot实验特异性地检测E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平，发现敲低GNB2L1支架蛋白的表达后，E-cadherin蛋白表达水平显著升高，而N-cadherin蛋白表达水平明显降低。该结果与以往报道一致，这意味着GNB2L1调控这两种蛋白表达，并可能在促进恶性黑素瘤细胞发生上皮间质转化中起着重要的作用，进而促进肿瘤细胞的侵袭和远处转移。因此，研究E-cadherin和N-cadherin在EMT过程中的相关机制有助于了解恶性黑素瘤细胞的侵袭和远处转移的生物学行为。
　　综上所述，笔者研究数据表明GNB2L1支架蛋白在恶性黑素瘤中表达，通过下调支架蛋白GNB2L1的表达可以有效抑制恶性黑素瘤细胞的增殖和迁移能力，并可能通过上调E-cadherin和下调N-cadherin抑制恶性黑素瘤细胞发生上皮细胞-间质转化实现的。因此，GNB2L1有望成为评估恶性黑素瘤发生、发展和迁移的临床生物标志物，并可能为恶性黑素瘤提供新的治疗靶点。
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　　[收稿日期]2018-11-19
　　本文引用格式：鄭舒丹，程诗萌，董亚兵，等.GNB2L1对恶性黑素瘤细胞增殖和迁移的影响[J].中国美容医学，2019，28（6）：59-63.
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