胃癌患者Hp感染的外周血MODCs成熟及活化分析
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[摘要] 目的 分析胃癌患者Hp感染的外周血MODCs成熟及活化。方法 随机选取2015年6月—2019年6月内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院消化内科胃癌患者60例，分为Hp阳性组（n=30）和Hp阴性组（n=30）两组，统计分析两组患者的外周血MODCs成熟标记分子表达率、IFN-γ、IL-12浓度、外周血MODCs致敏T细胞对胃癌细胞毒性杀伤率。 结果Hp阳性组CagA+菌株、CagA-菌株患者的外周血CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率均显著高于Hp阴性组（t=3.182、2.776、2.571、2.447、2.365、2.306、3.365、3.306、3.300、3.247，P<0.05），但CagA+菌株、CagA-菌株患者的外周血CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率之间的差异无统计学意义（t=1.886、1.638，、1.533、1.476、1.460，P>0.05）。Hp阳性组患者的IFN-γ、IL-12浓度均显著高于Hp阴性组（t=4.541、6.965，P<0.05），外周血MODCs致敏T细胞对胃癌细胞毒性杀伤率（40.4±7.0）%显著高于Hp阴性组（29.7±6.2）%（t=4.303，P<0.05）。 结论 胃癌患者Hp感染会对外周血MODCs成熟及活化进行刺激，促进癌细胞杀伤作用的提升。
[关键词] 胃癌;Hp感染;外周血MODCs成熟;活化
[Abstract] Objective To analyze the maturation and activation of MODCs in peripheral blood of patients with Hp infection in gastric cancer. Methods 60 patients with gastric cancer in the Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology from June 2015 to June 2019 were randomly selected and divided into two groups： Hp-positive group（n=30） and Hp-negative group （n=30）. The statistical analysis of the expression rates of mature marker molecules in peripheral blood MODCs， the concentrations of IFN-γ， IL-12， and the cytotoxicity of peripheral blood MODCs-sensitized T cells on gastric cancer cells were statistically analyzed. Results The expression rates of CD40， CD80， CD83， CD86， and HLA-DR in peripheral blood of patients with Hg-positive group CagA+strain and CagA- strain were significantly higher than those in Hp-negative group （t=3.182， 2.776， 2.571， 2.447， 2.365， 2.306， 3.365 ， 3.306， 3.300， 3.247， P<0.05）， but there was no significant difference in the expression rates of peripheral blood CD40， CD80， CD83， CD86， HLA-DR in patients with CagA+strain and CagA- strain （t=1.886， 1.638， 1.533， 1.476， 1.460， P>0.05）. The concentrations of IFN-γ and IL-12 in patients with Hp-positive group were significantly higher than those in Hp-negative group（t=4.541，6.965， P<0.05）. Peripheral blood MODCs sensitized T cells had cytotoxicity to gastric cancer cells （40.4±7.0）% The was significantly higher than that in the Hp-negative group （29.7 ± 6.2）% （t=4.303， P<0.05）. Conclusion Hp infection in patients with gastric cancer can stimulate the maturation and activation of MODCs in peripheral blood， and promote the killing effect of cancer cells.
[Key words] Gastric cancer; Hp infection; MODCs maturation in peripheral blood; Activation
在胃炎、消化性潰疡等致病因子中，幽门螺杆菌（Hp）占有重要地位，其直接而深刻地影响着胃癌的发生发展[1]。近年来，相关医学研究表明[2]，如果胃癌患者Hp感染，其就具有较好的预后，发生这一现象的原因可能为Hp将机体抗癌免疫激活并增强。但是目前，临床仍然没有明确其机制。该研究对2015年6月—2019年6月该院消化内科胃癌患者60例的临床资料进行了统计分析，分析了胃癌患者Hp感染的外周血MODCs成熟及活化，现报道如下。 1 资料与方法
1.1 一般资料
随机选取该院消化内科胃癌患者60例，分为Hp阳性组（n=30）和Hp阴性组（n=30）两组。Hp阳性组患者中男性20例，女性10例;年龄32～64岁，平均（52.4±6.1）岁;在TNM分期方面，18例为Ⅰ～Ⅱ期，12例为Ⅲ～Ⅳ期;在菌株方面，17例为CagA+，13例为CagA-。Hp阴性组患者中男性19例，女性11例;年龄33～64岁，平均（53.2±6.6）岁。在TNM分期方面，17例为Ⅰ～Ⅱ期，13例为Ⅲ～Ⅳ期。两组患者的一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。具有可比性。该研究所选病例经过伦理委员会批准，患者或家属知情同意。
1.2 方法
1.2.1 Hp感染鉴定 胃镜活检，将两组患者的3～5块病灶黏膜或胃窦组织取出来，在RPMI1640培养液中放置备用。采用Warthin-Starry银染色、14C呼气试验、快速尿素酶试验对Hp进行检测。Hp阳性标准为Hp快速诊断试纸向红色转变，SQT1034快速银染色药盒染色后发现Hp繁殖，或14C尿素呼气试验在100 dpm/mmol CO2及以上[3]。
1.2.2 外周血MODCs培养 将两组患者的30 mL外周血抽取出来，运用Ficoll法将DCs分离出来并重悬，在此过程中将无血清的含2 mmol/L L-谷氨酰（RPMI1640）充分利用起来，显微镜下将细胞密度调整为2×106/mL，在6孔板中铺细胞培养，将悬浮细胞吸弃，清晰后将贴壁细胞获取过来，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中加入，然后将重组人白细胞介素-4（rhIL-4）、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）依次加入，3 d半量换液1次，6 d后将重组人肿瘤坏死因子（rhTNF-α）加入，将未成熟的DCs获取过来。
1.2.3 DCs表面成熟标记分子检测 将5管100 μL/EP管未成熟的DCs细胞悬液取出来，将空白对照组设定为其中1管，将20 μL荧光抗体PE-HLA-DR、20 μL荧光抗体FITC-CD83、20 μL荧光抗体PE-CD86、20 μL荧光抗体PE-CD40分别加入其余4管，直接免疫荧光标记成功后检测，在此过程中采用日本Olympus流式细胞仪。
1.2.4 人干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-12（IL-12）检测 将培养第1周、2周的成熟DCs上清液分别取出来，应用ELISA试剂盒，运用酶联免疫吸附试验（ELISA）对IFN-γ、IL-12进行检测。
1.2.5 MODCs致敏T细胞对癌细胞的杀伤力检测 将效应细胞、靶细胞收集起来，按效靶比20∶1将效应细胞靶细胞混合液制备出来。将100 μL孔细胞培养液加入空白对照组，将50 μL孔靶细胞培养液、50 μL孔细胞培养液加入靶细胞自然释放组，将50 μL孔靶细胞培养液+10 μL细胞裂解液+40 μL细胞培养液加入靶细胞最大释放组，将50 μL孔效应细胞培养液、50 μL/孔细胞培养液加入效应细胞自然释放组，将100 μL/孔效靶细胞混合液加入实验组。培养后采用酶标仪在490 nm处对OD值进行测量。实验孔、靶细胞自发释放孔、效应细胞自发释放孔OD值之差与靶细胞最大释放孔、靶细胞自发释放孔OD值之差的百分比即为细胞毒活性[4]。
1.3 统计方法
应用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料用（x±s）表示，进行t检验;计数资料用率表示，进行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义
2 结果
2.1 外周血MODCs成熟标记分子表达率
Hp阳性组CagA+菌株、CagA-菌株患者的外周血CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR表達率均显著高于Hp阴性组（t=3.182、2.776、2.571、2.447、2.365、2.306、3.365、3.306、3.300、3.247，P<0.05），但CagA+菌株、CagA-菌株患者的外周血CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率之间的差异无统计学意义（t=1.886、1.638、1.533、1.476、1.460，P>0.05），见表1。
2.2 IFN-γ、IL-12浓度、外周血MODCs致敏T细胞对胃癌细胞毒性杀伤率
Hp阳性组患者的IFN-γ、IL-12浓度均显著高于Hp阴性组（t=4.541、6.965，P<0.05），外周血MODCs致敏T细胞对胃癌细胞毒性杀伤率（40.4±7.0）%显著高于Hp阴性组（29.7±6.2）%（t=4.303，P<0.05），见表2。
3 讨论
胃癌的症状主要是在肿瘤生长的部位导致的和上腹部相关的一些表现。早期的胃癌实际上很容易和一些良性胃病相混淆，包括慢性胃炎、消化性溃疡等，因此单靠症状也很难确定到底是胃的良性疾病，还是胃的恶性肿瘤。对于常见的胃癌症状，包括上腹的一些不适，实际上是由于肿瘤在胃体或者是在胃的其他部位，导致胃的消化功能受到影响。如果胃癌是位于贲门的地方，会牵拉胸骨后，出现一些异常。如果胃癌长在靠近幽门的地方，出现幽门梗阻，患者就会出现呕吐的症状，这是胃癌的一些常见的不适。
在对高效、特异的抗癌肿瘤进行诱导的过程中，树突状细胞（DCs）发挥着极为重要的作用。在胃癌预后的预测中，其实一个可靠指标[5]。近年来，相关医学研究表明[6]，Hp感染会对胃黏膜DCs表达造成影响。但是目前，还较少有相关医学研究报道胃癌患者外周血单核细胞来源树突状细胞（MODCs）成熟及活化受到Hp的影响。相关医学学者进行了胃癌抗原致敏DCs联合Hp抗胃癌免疫的实验[7-8]，结果表明，和Hp阴性胃癌患者相比，Hp阳性胃癌患者具有显著较高的MODCs致敏的T细胞对癌细胞的杀伤率（28% vs 40%）。该研究结果表明，Hp阳性组CagA+菌株、CagA-菌株患者的外周血CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率均显著高于Hp阴性组（P<0.05），但CagA+菌株、CagA-菌株患者的外周血CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率之间的差异无统计学意义（P>0.05）。Hp阳性组患者的IFN-γ、IL-12浓度均显著高于Hp阴性组（P<0.05），外周血MODCs致敏T细胞对胃癌细胞毒性杀伤率（40.4±7.0）%显著高于Hp阴性组（29.7±6.2）%（P<0.05），和上述相关医学研究结果一致，说明Hp感染一方面能够为MODCs活化提供良好的前提条件，另一方面还能够促进其癌细胞杀伤作用的提升。
综上所述，胃癌患者Hp感染会对外周血MODCs成熟及活化进行刺激，促进癌细胞杀伤作用的提升。
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（收稿日期：2019-12-11）
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