脊髓损伤对下丘脑c-Fos表达及神经细胞凋亡的影响

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　　[摘要] 目的 探討脊髓损伤后下丘脑神经细胞凋亡情况，确认脊髓损伤导致大脑损害的特点及其在相关并发症发生发展中的可能机制。 方法 18只SD大鼠随机分为两组：假模组（Sham组）和脊髓损伤组（SCI组），以改良的Allen’s撞击法制作脊髓损伤动物模型，常规饲养，分别于8周取大鼠下丘脑组织，应用免疫荧光染色法观察脊髓损伤大鼠下丘脑组织c-Fos表达，TUNEL法观察两组下丘脑神经细胞凋亡情况，应用ELISA法检测两组大鼠下丘脑炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表达。 结果 脊髓损伤后8周，SCI组较Sham组下丘脑c-Fos表达明显增加（P<0.05），同时下丘脑可见明显凋亡细胞，主要表现为胞浆减少，细胞核深染、固缩在一边;SCI组TUNEL阳性细胞数比Sham组明显增多，差异有统计学意义（P<0.01）;SCI组大鼠下丘脑包括TNF-α、IL-1β、IL-6等多种炎症因子水平较Sham组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。 结论 脊髓损伤可对下丘脑造成损害，表现为下丘脑神经细胞凋亡及炎症反应明显增加，其可能与c-Fos表达有关，脊髓损伤后对下丘脑的损害可能是某些并发症发生发展的发病机制。
　　[关键词] 脊髓损伤;下丘脑;c-Fos;神经细胞凋亡;炎症反应
　　[中图分类号] R651.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）21-0045-04
　　Effect of spinal cord injury on the expression of c-Fos in hypothalamus and neuronal apoptosis
　　SUN Peng YE Xiangming TIAN Liang LI Juebao CHENG Ruidong
　　Department of Rehabilitation Medicine， Zhejiang Provincial People's Hospital， People's Hospital of Hangzhou Medical College， Hangzhou 310014， China
　　[Abstract] Objective To investigate the neuronal apoptosis of hypothalamus after spinal cord injury， and to confirm the characteristics of spinal cord injury leading to brain damage and its possible mechanism in the occurrence and development of related complications. Methods 18 SD rats were randomly divided into two groups including sham module （Sham group） and spinal cord injury group（SCI group）. The animal model of spinal cord injury was made by modified Allen's impact method. And the rats were conventionally fed. Rat hypothalamus tissues were taken at the 8th week. The expression of c-Fos in the hypothalamus of spinal cord injury rats was observed by immunofluorescence staining. The neuronal apoptosis of hypothalamus in the two groups was observed by TUNEL method. The expressions of hypothalamic inflammatory factors（TNF-α， IL-1β， IL-6） of two groups were detected by ELISA method. Results Eight weeks after spinal cord injury， the expression of c-Fos in the hypothalamus of the SCI group was significantly higher than that of the Sham group（P<0.05）. At the same time， there were obvious apoptotic cells in the hypothalamus. The main manifestations werecytoplasm reduction， nucleus deep staining and shrinkage of the nucleus on one side. The number of TUNEL positive cells in the SCI group was significantly higher than that in the Sham group（P<0.01）. The levels of various inflammatory factors in the hypothalamus of the SCI group， including TNF-α， IL-1β， IL-6， were higher than those in Sham group， and the difference between the two groups was statistically significant（P<0.01）. Conclusion Spinal cord injury can cause damage to the hypothalamus， which is manifested by a marked increase in neuronal apoptosis and inflammatory response. This may be related to the expression of c-Fos. The damage of spinal cord injury to the hypothalamus may be the pathogenesis of the development of certain complications. 　　[Key words] Spinal cord injury; Hypothalamus; c-Fos; Neuronal apoptosis; Inflammatory response
　　脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）造成脊髓连续性结构和功能的破坏，切断了大脑与脊髓之间的联系，导致损伤平面以下运动和感觉功能的障碍及多种代谢紊乱，SCI中断了大脑与脊髓之间的反馈，致使损伤后的脊髓长期处于异常的应激状态[1-2]。有研究发现，脊髓损伤后脑部能够发生广泛而持续的炎症，造成神经细胞逐渐凋亡，导致患者认知障碍和精神障碍疾病的出现[3-4]，神经系统中，c-Fos基础表达水平很低，不易被检测到，只有在神经系统受到炎症因子刺激时才被激活，继而合成c-Fos蛋白。c-Fos的表达与神经细胞的凋亡关系密切[5]，下丘脑是调节神经-内分泌-免疫系统的枢纽，是应激反应和自主神经系统反应的关键调节系统，调控着人体诸如体温、摄食、激素水平、血糖和内分泌腺活动等重要的基本生理功能，下丘脑损伤被认为是部分情绪障碍疾病及代谢性疾病发病的脑内重要机制之一[6-8]，目前尚无研究报道脊髓损伤是否会对下丘脑造成损害，本研究旨在研究脊髓损伤后，下丘脑c-Fos的表达、神经细胞凋亡及炎症发生情况，明确脊髓损伤后对下丘脑的影响，为探讨脊髓损伤内分泌及代谢性并发症发生发展的可能机制提供依据。
　　1 资料与方法
　　1.1 实验动物及分组
　　纳入18只健康SD大鼠（6～8周龄，雄性，体重150～180 g，普通级，由上海斯莱克实验动物中心提供，经浙江省人民医院动物伦理委员会批准）为研究对象，经适应性饲养3 d后随机分为假模组（Sham组）和脊髓损伤组（SCI组），每组各9只。普通饲料组进食国家标准固体混合饲料，每日自由饮水。采用改良Allen’s法制备脊髓不完全性损伤大鼠模型，具体方法见模型制备介绍，Sham组实施相同的手术过程但不进行打击造成脊髓损伤。
　　1.2 脊髓损伤模型制备
　　SCI动物模型制备采用改良的Allen’s撞击法[7]。腹腔注射5%水合氯醛[国药集团（10009218）（300 mg/kg）体重]麻醉大鼠，背部剃毛后消毒，棘突定位后，以T10为中心作长约3 cm皮肤切口，钝性剥离脊旁肌肉暴露脊椎，微型咬骨钳咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，暴露脊髓，以上操作过程需特别注意硬脊膜完整。使用MASCIS Impactor（W.M. Keck Center of Rutgers University，USA）精确撞击（10 g，25 mm），造成脊髓不完全损伤。模型成功标志：出现大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢躯体回缩样扑动，脊髓打击部位淤血，双下肢驰缓性瘫痪。手术结束后，逐层缝合切口，消毒表皮。术后注意保温，单笼饲养，一日2次手工挤压膀胱帮助排尿，并保持小鼠身体干燥，每日测量体重，给予自由摄食与饮水，饲养8周后行后续试验。
　　1.3 组织切片制备
　　大鼠饲养8周后断头处死，冰上快速取脑组织并分离出下丘脑。将分离脑组织固定于4%多聚甲醛中[国药集团（10009218）]24 h。随后将目的部位脑组织修平整后放于脱水盒内。①脱水：将脑组织分别放进不同酒精浓度的脱水盒里进行脱水：50%酒精0.5 h→60%酒精0.5 h→75%酒精0.5 h→85%酒精0.5 h→90%酒精0.5 h→95%酒精0.5 h→无水乙醇I 0.5 h→无水乙醇Ⅱ 0.5 h→二甲苯Ⅰ 10 min→二甲苯Ⅱ 10 min→蜡Ⅰ 0.5 h 62℃→蜡Ⅱ 0.5 h 62℃→蜡Ⅲ 0.5 h 62℃。②包埋：包埋机内包埋浸好蜡的脑组织，首先将融化的蜡放入包埋框，将组织从脱水盒内取出，在蜡块凝固之前按照包埋面的要求放入包埋框，并贴上对应的标签，然后将蜡块置于-20℃冷冻台冷却，待蜡凝固后取出并修整蜡块。③切片：将修整好的蜡块置于切片机（德国徕卡公司）上切片，厚度7 μm。切片漂浮于摊片机将组织展平，用载玻片将其捞起，并放进62℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
　　1.4 免疫荧光染色
　　将组织冲洗，去除残留的固定液和杂质，脱水、浸蜡、包埋、切片，切片脱蜡后抗原修复，后PBS冲洗3次，每次5 min，加入兔抗大鼠c-Fos抗体（1：2000）（ThermoFisher，OSR00004W），4℃过夜避光孵育，次日复温30 min，PBS洗3次，5 min/次，加入羊抗兔荧光二抗（Proteintech，USA），37℃培养30 min，PBS洗3次，5 min/次，DAPI[Affinity（DF7097）]染色5 min，PBS洗3次，5 min/次，在显微镜上观察。
　　1.5 TUNEL染色
　　TUNEL试剂盒购于瑞士Roche Applied Science（11684817910）。依次将切片放入二甲苯Ⅰ 30 min→二甲苯Ⅱ 30 min→无水乙醇Ⅰ10 min→无水乙醇Ⅱ5 min→95%酒精5 min→90%酒精5 min→80%酒精5 min→70%酒精5 min→蒸餾水洗。PBS洗3次，每次5 min。将ProteinK200×储液用TBS稀释成1×的工作液，每张玻片加100 μL用湿盒孵育放在37℃ 培养箱15 min。切片浸入PBS 5 min每次洗3遍，每张切片取1 μL TDT和1 μL DIG-dUTP到18 μL Labeling Buffer里面混匀，TDT酶反应液现配现用。每张切片滴加20 μL TDT酶反应液，放入湿盒中，37℃孵育2 h。PBS洗3次，每次5 min，每张玻片滴加50 μL封闭液，室温孵育30 min。切片不洗涤，直接弃去封闭液，一抗用稀释液1：100的稀释，每张切片滴加100 μL生物素标记的一抗。37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，FITC标记的二抗用稀释液1：100的稀释，每张玻片滴加50 μL。37℃培养箱避光孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，注意避光操作，荧光显微镜下观察结果，拍照存留。 　　1.6 ELISA法检测各组大鼠下丘脑炎症因子表达
　　标准品[ELSA试剂盒（Neobioscience，China）]按照说明书进行稀释，将标准品和标本通用稀释液加入空白孔，标本或不同浓度标准品加入其余相应孔内，将反应孔用封板胶纸封住，放入36℃孵育箱内孵育90 min;洗板后抗体稀释液加入空白孔内，抗体工作液（100 μL/孔）加入其余孔内，避光孵育。酶结合物工作液避光室温放置，将酶结合物稀释液加入空白孔，酶结合物工作液（100 μL/孔）加入其余孔，避光孵育30 min;洗板5次，加入100 μL/孔显色底物，36℃孵育箱避光孵育15 min，最后加入终止液100 μL/孔，混匀后即刻测量OD450值。
　　1.7 统计学分析
　　图像分析采用Image-pro plus 6.0图像分析软件，每只大鼠选取3张切片，每张切片在损伤区随机采集5个高倍视野。采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 大鼠脊髓损伤后一般情况观察
　　模型制备大鼠打击后可見尾巴痉挛性摆动，双下肢躯体回缩样扑动，脊髓打击部位可见淤血。待大鼠苏醒后，发现动物静卧少动，气息微弱，食欲减退，数小时后可发现大鼠双后肢感觉迟钝、运动功能丧失，呈双下肢拖地爬行。
　　2.2 脊髓损伤后下丘脑c-Fos表达
　　脊髓损伤后8周，由封三图5A中可以看出，c-Fos主要表达于胞浆;相比Sham组（0.22±0.03），SCI组（0.29±0.04）大鼠下丘脑组织中c-Fos明显上调，差异有统计学意义（P<0.05），表明脊髓损伤对大鼠下丘脑组织中c-Fos表达有着重要影响，见封三图5B。
　　2.3 脊髓损伤后下丘脑神经细胞凋亡
　　脊髓损伤8周后，光学显微镜下发现Sham组表达少量阳性细胞，SCI组可见大量表达阳性细胞，主要表现为胞浆减少，细胞核深染、固缩在一边（阳性结果为绿色的圆形颗粒状细胞），见封三图6A;SCI组（11.46±0.14）TUNEL细胞凋亡指数比Sham组（8.02±0.28）明显增多，差异有统计学意义（P<0.05），见封三图6B。
　　2.4 两组大鼠下丘脑炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）水平变化
　　为观察SCI大鼠下丘脑炎症反应情况，采用ELISA法检测两组大鼠多种促炎细胞因子的水平，结果表明：脊髓损伤后，与Sham组比较，SCI组大鼠下丘脑中的多种促炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。
　　3 讨论
　　SCI患者全世界数百万人，这些患者大部分终身残疾[9]。脊髓中存在运动和感觉的传导束及下行运动神经元，脊髓损伤后会扰乱神经系统内的联系及通讯，导致基本神经功能的丧失和肢体瘫痪，不仅会给患者本人带来生理和心理上的极大伤害，严重影响患者的生活质量，还会对家庭乃至整个社会造成巨大的精神和经济负担。据统计，美国每天大约有30人诊断为脊髓损伤[10]。这些年来，SCI基础与临床的研究不断进展，其临床治疗也取得了飞速发展，其中包括细胞治疗[11-12]、基因治疗等[13-14]。Wagner FB等[15]研究发现，脊髓损伤患者在接受定向脊髓刺激后能够再次行走，是一项巨大突破，但是患者想要达到功能的完全康复仍面临着巨大挑战，SCI后多发的并发症严重影响着患者的生活质量[1-2]，这其中包括肌肉萎缩、慢性疼痛、尿路感染和压疮等[16]。SCI的继发性改变很难完全依靠局部的机制来解释，因此神经系统内环境受刺激后的改变等所产生的炎症等方面的作用已日渐受到重视。SCI后由于上行感觉纤维和下行运动传导束的中断，破坏脊髓与大脑的生理联系，导致脊髓和脑部功能之间关联的损害，之前大部分针对脊髓损伤的研究均集中于揭示脊髓损伤所引发的症状及并发症，忽视了SCI对大脑所引发的效应，已有研究显示SCI可引起脑内小胶质细胞活化，导致脑内发生慢性炎症过程[17-18]。Felix MS等[19]也发现，SCI不仅引起脊髓细胞的凋亡和死亡，在大脑皮质和海马中也引起该部位神经细胞的凋亡。Wu J等[20]一项研究也证实SCI会引起关键大脑区域神经细胞的逐渐受损，存在持续退化过程，这些损伤包括炎症、神经细胞缺失及其并发的认知力下降及损伤后的精神症状。
　　 下丘脑-垂体-肾上腺轴是体内应激反应关键调节系统，下丘脑轴在由神经递质和神经调质所介导的应激反应调节网络中扮演重要角包。下丘脑既可以接受末端信息，又能调节交感神经系统和神经内分泌功能，构成了下丘脑-垂体-肾上腺轴核心，而且是神经系统高级整合中枢，对实现内环境稳定有着十分重要的作用，SCI后下丘脑也是其中易受影响的神经核团之一[21]，徐又佳等[22]研究发现SCI影响正常神经信号在大脑中枢传导，下丘脑室旁核、视上核可产生明显反应，因此明确SCI是否对下丘脑造成损害对研究SCI后内分泌及代谢相关并发症尤为重要。针对SCI后可能对下丘脑造成的损害，本研究通过观察SCI大鼠神经细胞凋亡情况发现，脊髓损伤后可见明显凋亡细胞，与对照组比较神经细胞凋亡数量明显增多，同时为观察SCI大鼠下丘脑炎症反应情况，采用ELISA法检测了两组大鼠多种促炎细胞因子的水平，结果表明脊髓损伤后下丘脑中的多种促炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高，说明脊髓损伤可导致下丘脑神经细胞凋亡，并增加其炎症反应。当细胞受刺激时如缺血、缺氧、损伤等情况，其核内的c-Fos原癌基因被激活并表达蛋白，目前认为在细胞凋亡过程中适度的c-Fos蛋白表达参与了DNA的损伤修复，而进一步的表达增加将干预修复功能并使细胞凋亡，在某些情况下c-Fos表达是引导细胞凋亡基因调控通路中的一个必需成分，c-Fos蛋白的表达与凋亡有必然的联系，中断了细胞内的信号传导而诱导凋亡[23]，本研究中观察到脊髓损伤后下丘脑c-Fos表达明显增加，c-Fos的过度表达可能是导致脊髓损伤后下丘脑细胞凋亡的原因之一。本研究中选取的时间点为脊髓损伤8周后，说明急性期的应激反应后SCI仍对下丘脑造成持续性的慢性损害，临床观察中脊髓损伤容易存在合并精神症状及代谢性疾病的可能，脊髓损伤对下丘脑的损害可能是其并发症发生发展的致病机制，这尚待进一步研究。 　　綜上所述，脊髓损伤可对下丘脑造成损害，表现为下丘脑神经细胞凋亡及炎症反应明显增加，其可能与c-Fos表达有关，脊髓损伤后对下丘脑的损害可能是某些并发症发生发展的发病机制。
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　　（收稿日期：2020-01-10）
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