多种单味中药对禽多杀性巴氏杆菌C48-1的抑菌作用研究

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　　摘要：试验选取厚朴酚、黄藤素、秦皮、大黄素和黄柏5种中药提取物，采用药敏纸片法和布氏肉汤稀释法对禽多杀性巴氏杆菌C48-1进行抑菌试验。体外抑菌试验结果表明，厚朴酚、黄藤素和秦皮提取物的抑菌圈大小分别为22.0、11.3、15.6 mm，最小抑菌浓度（MIC）分别为8、256、64 μg/mL，最小杀菌浓度（MBC）分别为16、512、256 μg/mL;大黄素和黄柏提取物对C48-1没有抑菌作用;厚朴酚的抑菌作用最强，秦皮次之，黄藤素最弱。培养禽多杀性巴氏杆菌C48-1时，培养基中加入厚朴酚含量为6 μg/mL时，细菌的生长速度相比对照组受到明显抑制，当药物浓度为MIC（8 μg/mL）值时，禽多杀性巴氏杆菌C48-1生长被完全抑制。从体内抑菌试验结果可知，厚朴酚对禽多杀性巴氏杆菌C48-1侵染江汉鸡的保护力最高，为50%。该结果为进一步研制中药制剂预防禽多杀性巴氏杆菌病提供了理论基础。
　　关键词：中药提取物;禽多杀性巴氏杆菌;抑菌作用
　　中图分类号：S859.3;R282.71         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）07-0089-03
　　Abstract： The experiment was conducted to explore the inhibition effect of magnolol，palmatine，cortex fraxini，emodin and cortex phellodendri on avian Pasteurella multocida C48-1 determined by disk diffusion method and double dilution method. The results of vitro antibacterial effect indicated that the diameter of inhibition zone of magnolol，palmatine，cortex fraxini were 22.0，11.3，15.6 mm，and the MIC were 8，256，64 μg/mL，and the MBC were 16，512，256 μg/mL，respectively. Emodin and cortex phellodendri had no antibacterial effect on P.multocida C48-1. Magnolol had the strongest antibacterial effect， followed by cortex fraxini，and palmatine had the weakest antibacterial effect on P.multocida C48-1. When P.multocida C48-1 were cultured in the content that magnolol was 6 μg/mL，the growth rate was significantly inhibited compared with the control group. P.multocida C48-1 won’t be completely inhibited until the magnolol’s content reached 8 μg/mL. According to the results of vivo antibacterial effect， the protective rate of magnolol was up to 50% when Jianghan chickens was infected by P. multocida C48-1. This study also provides an important basis for further studying to protect avian P. multocida disease.
　　Key words： extracts of traditional Chinese medicine; avian Pasteurella multocida; antibacterial effect
　　禽多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）为无芽孢、不运动、兼性厌氧、菌体两端常染色浓重的革兰氏阴性小杆菌[1]。在动物养殖业中，禽多杀性巴氏杆菌可使鸡发生禽霍乱，导致养殖户严重的经济损失[2]。目前主要采用抗生素防治禽多杀性巴氏杆菌，但抗菌药物的不合理应用，特别是将抗菌药物作为抗菌生长促进剂添加到饲料中，使巴氏杆菌表现为耐药率高、耐药范围广、呈多重耐药等特点，而且加剧了抗生素在动物体内的殘留，严重危害了动物食品安全[3，4]。中药具有抗菌消炎、无残留、不易产生耐药性等优点。中药的使用可以降低抗生素类药物残留，减少耐药性[5]。国内外文献报道，未见有对禽多杀性巴氏杆菌有较好抑菌效果和保护效果的中药。
　　试验采用药敏纸片法、微量肉汤稀释法对厚朴酚、黄藤素、大黄素、秦皮和黄柏等中药提取物对禽多杀性巴氏杆菌C48-1的体外抑菌作用进行检测，同时对抑菌效果较好的厚朴酚进行体内抑菌试验，旨在找到有较强抑菌作用、能够防治禽霍乱的中草药制剂。
　　1  材料与方法
　　1.1  菌株与主要试剂
　　禽多杀性巴氏杆菌（C48-1）菌株购于中国兽医药品监察所，TSA、TSB培养基购自美国BD公司，MH肉汤培养基购自青岛海博生物技术有限公司，聚乙二醇400购自索莱宝科技有限公司，厚朴酚、秦皮、黄藤素、大黄素和黄柏提取物由湖北省农业科学院中药材研究所提供。 　　1.2  主要仪器设备
　　37 ℃恒温培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司），微量紫外-可见光分光光度计（NanoDropTMOneC），超声波清洗机（墨洁S3000），精密分析天平。
　　1.3  中药药液的制备
　　将中药称量少许溶于50% PEG400中，用超声波振荡助溶，再用0.22 μm滤膜过滤，使药液浓度相当于4 096 μg/mL，4 ℃保存，备用。
　　1.4  单味中药提取物抑菌圈直径的测定
　　将滤纸片用直径6 mm打孔器打成圆片，120 ℃干热灭菌2 h。在无菌条件下，将纸片放入中药药液中，室温浸泡2 h，用培养皿干燥法干燥，4 ℃保存备用。以MH培养基培养新鲜的禽多杀性巴氏杆菌C48-1，使OD600 nm值在0.5左右，将菌液均匀涂布于MHA平板上，待干燥后将中药药敏纸片均匀分布于琼脂表面，每个平板3次重复，37 ℃培养24 h后用直尺测量抑菌圈直径。
　　1.5  单味中药提取物最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）的测定
　　取菌液50 μL分别加入含有不同浓度中药的肉汤培养基中，肉汤培养基中中药的浓度自第1孔开始依次倍比释释至第11孔，第12孔不加中药提取液，作为空白对照。每孔肉汤培养基和药液各50 μL，
　　37 ℃培养24 h后取出，观察细菌生长情况，与浊度对照组比较，以肉眼观察无细菌生长的最低浓度判定为中药的最小抑菌浓度MIC值。将上述中药组中的细菌被完全抑制的管中液体取100 μL接种涂布于MH琼脂培养基平板上，经37 ℃培养24 h后观察结果。以肉眼观察菌落不生长视为100%被杀灭，此最低药物浓度值为其最小杀菌浓度MBC值。
　　1.6  生长曲线的测定
　　划线接种禽多杀性巴氏杆菌C48-1，挑单菌落接种于10 mL新鲜TSB培养基中，37 ℃，220 r/min摇床过夜培养，按1%的接种量接种于TSB培养基，添加厚朴酚药液使厚朴酚终浓度分别为0、2、4、6、8 μg/mL，每隔1 h测定一次OD600 nm值，绘制生长曲线。
　　1.7  厚朴酚体内抑菌试验
　　购置60只50～60日龄江汉鸡，分为4组;第一组、第二组和第三组给药剂量按每千克体重2.5 mg拌服料喂，分别为143 mg/（只·d）、286 mg/（只·d）和429 mg/（只·d）;第四组为对照组（不添加任何药物）。再从-80 ℃冰箱复苏禽多杀性巴氏杆菌C48-1菌株，10倍稀释8个梯度，攻毒经饲喂7 d的江汉土鸡，并将攻毒菌液涂布TSA进行平板计数，观察鸡只健康情况，记录试验结果。
　　2  结果与分析
　　2.1  单味中药提取物抑菌圈直径大小
　　5种中草药提取物对禽多杀性巴氏杆菌C48-1的抑菌圈大小见表1。从表1可以看出，厚朴酚、黄藤素和秦皮对禽多杀性巴氏杆菌C48-1均有一定的抑菌作用，其中厚朴酚的抑菌效果最佳;大黄素和黄柏提取物对禽多杀性巴氏杆菌C48-1没有抑菌效果。
　　2.2  单味中药提取物最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）
　　厚朴酚、黄藤素和秦皮的MIC、MBC结果见表2。从表2可以看出，厚朴酚对禽多杀性巴氏杆菌C48-1的MIC为8 μg/mL，MBC为16 μg/mL;黄藤素的MIC为256 μg/mL，MBC为512 μg/mL;秦皮的MIC为64 μg/mL，MBC为256 μg/mL;因此，后续选择抑菌和杀菌效果最好的厚朴酚进行体内抑菌试验。
　　2.3  厚朴酚对禽多杀性巴氏杆菌增殖的影响
　　由图1可以看出，加入厚朴酚为6 μg/mL时，细菌的生长速度相比对照组受到明显抑制，在第2～8小时恢复生长，但总体比对照组慢很多。最终OD600 nm最大值均接近1.5，说明厚朴酚能减缓禽多杀性巴氏杆菌C48-1的生长，但不影响生长极限。当药物浓度为MIC值（8 μg/mL）时，OD值为一条水平直线，禽多杀性巴氏杆菌C48-1生长被完全抑制。
　　2.4  厚樸酚对禽多杀性巴氏杆菌C48-1的体内抑菌结果
　　由平板计数结果得知，禽多杀性巴氏杆菌C48-1对江汉鸡的攻毒量为50 CFU。由表3可知，添加厚朴酚的试验组存活率高于对照组，且随着中药剂量的增加，保护率由第一组的10%提高到第二组的50%，继续增加厚朴酚剂量，保护率稳定在50%不再增加，说明厚朴酚对江汉鸡体内感染禽多杀性巴氏杆菌C48-1有一定的保护作用，但不能达到完全抑菌。
　　3  小结与讨论
　　禽霍乱是由禽多杀性巴氏杆菌引起的接触性败血性传染病，感染后发病率快，死亡迅速，死亡率高。中药作为抗生素的良好替代物，在禽病防治中逐渐得到应用[6]。本试验发现，厚朴酚、黄藤素对革兰阴性菌禽多杀性巴氏杆菌C48-1有抑菌活性，其中厚朴酚抑菌效果较强。这与牛国一等[7]报道的结果一致。李辉明[8]研究表明了牛致病性巴氏杆菌对秦皮和蒲公英两种药物低度敏感，这与本试验中秦皮对禽多杀性巴氏杆菌有中度抑菌效果基本一致。
　　中药的不同提取部位抑菌活性不同，大多数中药的有效提取物对细菌、病毒等都有一定的抑制作用。张海晖等[9]报道了大黄提取物大黄素对禽巴氏杆菌的抑菌圈为12.02 mm，MIC为28.13 μg/mL。曲径等[10]研究发现，黄柏、艾叶、黄连、地榆有效部位提取物对巴氏杆菌的MIC为7.8 mg/mL。常超越等[11]发现鸡源多杀性巴氏杆菌对黄柏高度敏感。这与本试验的结果存在差异，可能是由于中药提取方法和工艺不同，得到的有效成分和纯度不同，从而导致抑菌结果存在差异。
　　厚朴酚对禽多杀性巴氏杆菌的生长曲线显示，当厚朴酚浓度≤1/2 MIC时，禽多杀性巴氏杆菌活性部分被抑制，添加厚朴酚试验组比对照组进入对数期时间推迟，但厚朴酚不影响细菌的生长极限;当厚朴酚浓度在1/2 MIC～MIC时，禽多杀性巴氏杆菌活性明显被抑制;谢丽玲等[12]研究黄芩醇对副溶血性弧菌的抑制机制时，也发现了添加中药后细菌进入对数期时间被延长。厚朴酚体内抑菌试验结果表明，江汉鸡在连续添加不同剂量厚朴酚的饲料饲喂7 d后，用禽多杀性巴氏杆菌C48-1攻毒，饲喂剂量从143 mg/（只·d）增加到286 mg/（只·d），保护率从10%增长到50%，进一步增加中药剂量，保护率不再上升，可能与鸡只对中药的吸收和代谢相关。 　　目前，中药替代抗生素进行禽病防控的需求越来越大，中药富含多种活性的化学抗菌物质，但是中药的抗菌机理尚未研究明确，有待进一步研究。本研究为进一步研发中药制剂预防禽多杀性巴氏杆菌病提供了一定的理论基础。
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　　[11] 常超越，张召兴，李蕴玉，等.20种单味中草药对鸡源多杀性巴氏杆菌的体外抑菌试验[J].黑龙江畜牧兽医，2017（14）：156-157.
　　[12] 谢丽玲，彭  齐，蔡链纯，等.黄芩醇提物对副溶血性弧菌抑制机制的研究[J].生物技术通报，2015，31（8）：159-165.
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