蝴蝶兰成花分子生物学研究进展

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　　摘要：蝴蝶兰花型独特且高度进化，是单子叶植物中研究花发育生物学的理想材料。近年来随着分子生物学技术的不断提高，蝴蝶兰成花基因的研究取得重大进展。本研究从蝴蝶兰开花转换和花器官形成两方面对近年来国内外有关蝴蝶兰花发育分子机理的研究进展进行整理与归纳， 并对蝴蝶兰花发育需解决的问题进行探讨，以期为加快分子生物学技术在蝴蝶兰研究中的应用提供参考。
　　关键词：蝴蝶兰;花器官发育;成花诱导;基因;开花整合子
　　中图分类号：S682.31文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）07-0161-06
　　蝴蝶兰（Phalaenopsis aphrodite Rchb. F.）为兰科蝴蝶兰属，又称蝶兰[1]，原产于亚热带雨林地区。蝴蝶兰素有“洋兰王后”之称，尤其在新春时节，叶腋抽出长长的花梗，开出形如蝴蝶飞舞般的花朵，花形美丽别致、色彩艳丽、花期长，深受花迷们的青睐[2]。
　　 蝴蝶兰起源古老，花型独特且结构高度特化，具有花瓣状的萼片、特异的唇瓣，其雌雄蕊合生成合蕊柱并且子房发育须由授粉来启动，是单子叶植物中研究花发育进程的理想材料[3，4]。随着研究的不断深入，传统手段已难以对蝴蝶兰进行更深入的探索，分子育种技术的应用显得尤为重要。花期调控技术是近年来研究的热点，但对于蝴蝶兰成花机理和诱导途径还不够清晰。因此深入了解各类型蝴蝶兰花芽分化基因的表达模式，分析其成花诱导的基本途径以及各途径间的交叉影响关系，对于丰富蝴蝶兰成花理论、解决生产中的问题、推动其在中国的发展具有重要的价值和意义。
　　1 蝴蝶兰花芽诱导相关基因的研究进展
　　 植株在外界环境和遗传因子的双重作用下，控制成花的相关基因在时间和空间上按一定顺序表达，茎顶端分生组织由营养生长转变为生殖生长的过程称为成花诱导。这不仅仅是植物生长发育过程中的重要转折时期，也是对生产产生直接影响的重要时期[5]。近年来，开花调控逐渐成为植物分子生物学研究的热点。目前已知的高等植物成花诱导途径共有7种，分别是光周期途径、春化途径、温敏途径、自主途径、赤霉素途径、年龄途径和环境温度途径 [6-9]，它们既彼此独立，又相互交织。现已证实拟南芥中存在3个开花途径整合因子SOC1、LFY和FT，其成花诱导途径主要通过调节FT、SOC1和LFY等开花信号整合因子的表达水平来精确地调控花分生组织中相关基因的表达，进而调节成花转换、控制开花时间和启动植物的开花过程。它们拥有共同的下游目标调节基因CO和FLC，其中CO是光周期途径的中心关键基因，而FLC是春化途径和自主途径的集合点[10]。
　　1.1 FT基因
　　 FT基因是重要的开花促进基因，在植物成花过程中发挥着不可替代的作用，有‘开花素’之称。FT基因在拟南芥晚花突变体中首次被发现，它是植物开花调控途径的中心结点基因，能够整合来源于光周期途径、春化途径和自主途径的花发育信号。在光周期调控途径中，FT基因是关键因子CO下游的直接靶基因，它在叶片中表达，进而激活茎顶花序分生组织基因，从而促进花的形成。在环境温度途徑、年龄途径中能促进下游LFY基因的表达，在春化途径和自主途径中，FT基因是FLC基因的靶基因。由此可见FT基因在植物成花途径的交汇节点发挥着重要作用[11-13]。
　　 目前在蝴蝶兰中已分离到FT的同源基因PHFT和PaFT1。Li等[14]研究发现蝴蝶兰的FT同源基因PHFT主要在根、叶片、花等部位表达，其中在花的心皮和花瓣中的表达量最高，且幼花中的表达量高于成熟花，并且在ft-1突变拟南芥中超表达PhFT基因会导致早花及角果缺失。而Jang等[15]发现FT同源基因PaFT1主要在白蝴蝶兰花梗和花芽中表达，且低温能够诱导PaFT1的表达量显著上升，但光周期处理对其表达量无明显影响。
　　1.2 SOC1基因
　　 SOC1基因广泛存在于单子叶和双子叶植物中，大多含有7个外显子和6个内含子，编码一个MADS结构域蛋白，具有典型MIKC类的MADS-box基因家族的结构特征[16]。研究表明，SOC1是一个多功能蛋白，主要调节开花时间，并且对花的类型及分生组织的发育也有调节作用[17]。前人通过基因突变及蛋白亚细胞定位技术已初步了解 SOC1所编码蛋白的功能。SOC1基因与其它基因蛋白共同作用，在植物生长发育过程中发挥着不可替代的作用。崔波等[18]研究发现，SOC1基因在蝴蝶兰不同时期不同部位的表达量不同，根中SOC1基因表达量在营养生长期达到最高，叶中则是抽葶期的表达水平最高，而在子房发育期只有微量表达，但在盛花期、抽葶期、子房发育期的花葶中表达量均达到较高水平，表明SOC1基因不但调控蝴蝶兰的营养生长，也参与调控生殖生长，包括促进开花和影响蕊柱和子房的发育，但对花器官外轮的形成几乎无影响。李思谊[19]从姬蝴蝶兰（Phal.equestris）中分离到1个SOC1同源基因PeSOC1并对其表达量进行研究，发现该基因在植株开花后2周叶片中的表达最强，花中最微弱;将此基因转入野生型拟南芥与SOC1、FT突变株后发现T1、T2子代均能提早开花，推测PeSOC1基因能够正向调控开花时间。
　　1.3 LFY基因
　　 LFY是花分生组织基因，广泛表达于营养器官与生殖器官，并与调控开花时间的基因密切相关。它是整合环境信号与内源信号的开花控制因子，能够启动植物开花过程，并且控制花的生长发育。现已在蝴蝶兰中鉴别出LFY的同源基因，如Zhang等[20]从蝴蝶兰中克隆出LFY的同源基因PhapLFY，其在营养器官与生殖器官中均有表达，且在营养生长向生殖生长转换时，茎中的表达量呈逐渐升高趋势，尤其在花发育过程中，花序分生组织、花分生组织和花原基中均有较强表达，说明PhapLFY基因可能参与蝴蝶兰生殖发育的调控;白蝴蝶兰中LFY的同源基因PhapLFY则主要在花原基和处于发育时期的花序中表达，可以缓解拟南芥lfy突变体的花器官畸形[21]。 　　2 蝴蝶兰花器官发育相关基因的研究进展
　　花发育的ABC模型在1990年被提出，随后科学家又发现了D类基因[22]和E类基因[23]，并衍生出“ABCDE”模型，即花发育是由A、B、C、D、E同源异型基因所调控。其中每个字母表示一类功能，A+E控制花萼发育，A+B+E控制花瓣发育，B+C+E控制雄蕊发育，C+E控制心皮发育，D+E控制胚珠发育[24，25]。
　　2.1 A类基因
　　 蝴蝶兰A类基因的研究相对较少.主要包括FUL-like和AP1基因。袁秀云等[26]从朵丽蝶兰中克隆出1个A类基因AP1，发现其主要在根和叶中表达，在花器官中痕量表达，推测其可能参与调控植株开花进程，而不参与花器官的形态建成。研究发现，AP1基因在蝴蝶兰营养器官与生殖器官中均有表达，且在盛花期花葶中表达量最高，推测其与调控开花有密切关系[27]。另外，Chang等[28]证实FUL-like基因ORAP11和ORAP13在蝴蝶兰营养器官和生殖器官均有表达，ORAP11仅在蕊柱中有表达，而ORAP13在花器官中均不表达，但二者在植株的成花转变及形态构建过程中均起到重要作用。
　　2.2 B类基因
　　 B类基因具有调控第2、3轮花器官（花瓣和雄蕊）发育的功能，以PI和AP3为代表，它们相互结合发生作用，并存在自动调控机制。现已在蝴蝶兰中分离到多个B类基因的同源基因。
　　 Tsai等[29]对从小兰屿蝴蝶兰中分离出的4个DEF-like基因PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4、PeMADS5进行分析，得到PeMADS基因的作用贯穿于整个花发育过程，但表达方式存在较大差异;PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4、PeMADS5基因在野生型蝴蝶兰的整个花器官中均有表达，其中PeMADS2基因在花萼、花瓣中表达量最高，在蕊柱中弱表达，在唇瓣中不表达，证明其与花被片发育密切相关;PeMADS3基因在花瓣、唇瓣、蕊柱中表达，而在花萼和花粉中无表达，证明其与花瓣发育密切相关;PeMADS4基因仅在唇瓣、蕊柱中高表达，表明其与唇瓣发育有关;PeMADS5基因在花瓣中高表达，而在萼片、唇瓣、蕊柱中仅微量表达，表明其与侧瓣发育有关。此外还分离到1个GLO/PI-like基因PeMADS6，其在除花粉块外的花器官中均有表达，在花衰老进程中，花中PeMADS6基因的表达量降低，但只有在由授粉诱导的花衰老过程中，子房中PeMADS6基因的表达量才会减弱，可见授粉会调控该基因在子房中抑制表达。
　　 Guo等[30]从蝴蝶兰中克隆得到3个PI-like基因PhPI9、PhPI10、PhPI15和1个PhAP3基因，研究结果表明3个PI-like基因均在生殖发育阶段表达，在营养生长阶段不表达;PhPI9、PhPI10仅在唇瓣中表达，PhPI15与PhAP3在所有花器官中均有表达，PhAP3在药帽处高表达，且与雄性不育相关。张浩等[31，32]通过对蝴蝶兰PhAP3基因的研究发现，其在营养器官和花器官中均有表达，在花芽、萼片、捧瓣中高表达，在根和叶中微量表达，证实PhAP3在花发育过程中起重要作用，且与蝴蝶兰的萼片花瓣化有关。
　　 袁秀云等[33]从蝴蝶兰花瓣中克隆了一个B类BGLO/PI转录因子PhalPI，分析结果表明PhalPI基因仅在生殖器官中表达，且在授粉后的子房中表达量降低，这与PeMADS6基因表达模式相同;PhalPI基因的表达量在萼片唇瓣化突变体的萼片和蕊柱中显著升高，在雄蕊花瓣化突变体的萼片和侧瓣中降低，在唇瓣和蕊柱中的表达水平显著升高，在侧瓣合柱化突变体的蕊柱中也显著升高，但在侧瓣唇瓣化和侧瓣花药化突变体中的表达水平无明显变化。由此可见，PhalPI基因与花器官形态突变密切相关，而与侧瓣唇瓣化和侧瓣花药化突变无关。
　　2.3 C类和D类基因
　　 C、D类基因具有较高的同源性，与植物生殖发育密切相关。拟南芥中C类功能基因主要有AG，主要参与调控雄蕊与雌蕊发育;D类基因主要有STK、SHP1和SHP2，主要调控胚珠发育。
　　 Song等[34]在蝴蝶兰中分离鉴定出2个AG-like基因PhalAG1和PhalAG2，分别属于C类和D类基因，两基因具有相似的表达模式，在唇瓣、蕊柱和胚珠中均表达，且仅在花芽中表达，在营养器官中均无表达。陈佑亦[35]从姬蝴蝶兰中分离鉴定出1个C类基因PeMADS1和1个D类基因PeMADS7，发现它们在合蕊柱和胚珠发育均起到重要作用且具有一定的协同作用。
　　 袁秀云等[36，37]从蝴蝶兰中克隆到2个C类MADS-box基因PhAG1a和PhAG1b，研究表明PhAG1a基因与PhalAG1、PeMADS7基因关系相近，且只在植物蕊柱和子房中表达，在营养器官中不表达。在5类花器官突变体中，PhAG1a基因在3类花器官突变体（退化雄蕊变异为侧瓣、蕊柱合生和侧萼片变异为唇瓣与侧瓣退化）中的表达没有变化，但在2类花器官突变体（侧瓣变异为唇瓣和侧瓣顶端长出花药）蕊柱中的表达水平明显降低，因而推测其在调控蝴蝶兰合蕊柱发育中起重要作用。PhAG1b基因只在蕊柱和子房中表达，在营养器官与花器官的萼片、侧瓣和唇瓣中均不表达，在授粉后的子房中和2类花器官突变体（侧萼和侧瓣变异为唇瓣）蕊柱中的表达水平明显降低，在退化雄蕊变异为花瓣的花器官突变体中表达没有明显变化，而在另2类花器官突变体（侧瓣退化与蕊柱合生、侧瓣顶端长出花药）蕊柱中的表达显著升高。表明PhAG1b基因主要參与调控花器官中蕊柱和子房发育，其功能或与B类基因的功能互为消长。
　　2.4 E类基因
　　 E类基因与AP1/FUL基因相同，只存在于被子植物中，主要包括SEP1、SEP2、SEP3、SEP4等基因。SEP基因和A类、B类、C类基因同时表达，能够使营养叶转变为花器官[38]。郑至勤[39]从姬蝴蝶兰中克隆到2个E类基因PeMADS8、PeMADS9，证实它们在唇瓣中特异表达，与B类基因PeMADS4相似，推测其可能与唇瓣发育有关。同时也从姬蝴蝶兰的EST库中筛选到PeEREBP1、PeEREBP2、PebHLHL1，均与PeMADS4的表达特性相似，可能也与唇瓣发育相关。 　　 Pan等[40]證实从小兰屿蝴蝶兰分离到的PeSEP1、PeSEP2、PeSEP3、PeSEP4基因均与蝴蝶兰花器官的形成有关。罗云汝[41]认为AGL6-like基因在营养和生殖器官中均有表达，能促进植株开花。
　　3 其它相关基因的研究进展
　　 CONSTANS（CO）是光周期调控途径中的关键基因之一，作为光周期下游基因可以将光信号转换为开花信号传递给FT基因，从而促进植物开花[42，43]。Zhang等[20]通过研究蝴蝶兰中分离的CO-like基因PhalCOL发现，它在所有器官中均有表达，且在营养生长向生殖生长转换过程中茎中的表达量较高，而过度表达会导致早花，同时还发现花芽发育会影响PhalCOL基因的表达。由此可推测PhalCOL基因与蝴蝶兰花芽诱导密切相关。
　　 EFL4基因属于光周期途径调控植物成花的基因，在植物成花中起着关键作用。DhEFL2、DhEFL3、DhEFL4基因是朵丽蝶兰光周期途径上游基因EFL4的同源基因，Chen等[44，45]研究发现其在营养器官与生殖器官中均有表达，且在花芽形成初期表达量最高;在长日照条件下，DhEFL2、DhEFL3、DhEFL4基因的日表达规律较为相似，而在短日照条件下，基因DhEFL3的表达规律与DhEFL2、DhEFL4存在一定差异;在拟南芥中3个基因超量表达均会出现晚花现象。
　　 Zhang等[46，47]分离出两个与植物自主途径调控开花的关键基因DhPRP39、DhFVE，发现其参与蝴蝶兰的成花诱导过程，推测其在花序启动过程中发挥着重要作用。同时还发现过量表达的DhPRP39和DhFVE基因均会不同程度地延迟拟南芥开花。
　　 Bui等[48]发现3种ACC合成酶基因在蝴蝶兰受粉后的子房发育过程中起着重要作用，生长素、乙烯均可诱导该基因与ACC氧化酶的mRNA在花器官中积累，而去雄蕊后则无法诱导其在花器官中表达。
　　4 前景与展望
　　 蝴蝶兰成花过程的分子生物学研究已取得很大进展，但目前的研究大多是针对单一因素进行，很少有综合多种因素的研究，因此，综合多种因素对蝴蝶兰成花分子机制进行研究并探索不同类型成花基因的互作关系，是未来蝴蝶兰分子生物学研究的重要方向。同时，目前国内外对蝴蝶兰基因的研究主要集中在花启动、花发育等方面，对花色和香气基因的研究报道较少，花色、香气是蝴蝶兰等兰科植物的重要品质因素，因此对花色素苷合成中的调控因子和相关香味基因的研究应加强。
　　 深入研究蝴蝶兰成花过程中的相关基因，将有利于通过基因工程改善蝴蝶兰花品质及更好地进行花期调控，同时为我们利用基因改造花部性状、改变花的育性提供可能。这对推动蝴蝶兰分子育种进程具有重要意义，同时可结合温度、光照、湿度等环境因素为蝴蝶兰产业提供新的理论依据。
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