辽宁省花生网斑病病原菌鉴定及生物学特性研究

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　　摘要：为确定辽宁省花生（Arachis hypogaea Linn.）网斑病病原菌，采用柯赫氏法则，测定从病样中分离的纯培养物致病性，根据其形态学特性及ITS序列分析，对病原菌进行鉴定。采用菌落生长法及凹载玻片萌发法研究病原菌生物学特性。结果表明，辽宁省花生网斑病病原菌为Peyronellaea arachidicola。菌丝生长最适温度为23 ℃，最佳碳源为麦芽糖、最佳氮源为酵母膏，最适pH为7，光暗交替有利于菌丝生长，菌丝致死温度为45 ℃。分生孢子萌发的最适温度为25 ℃，最适pH为7，光照条件有利于分生孢子萌发。
　　关键词：花生（Arachis hypogaea Linn.）;花生網斑病;派伦霉（Peyronellaea arachidicola）;生物学特性
　　中图分类号：S435.652         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）02-0082-05
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.017           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Identification and biological characteristics of the pathogen
　　from peanut web blotch in Liaoning province
　　XIE Jin-hui，LIN Ying，ZANG Chao-qun，PEI Xue，LIANG Chun-hao
　　（Plant Protection Research Institute，Liaoning Academy of Agricultural Sciences， Shenyang 110161，China）
　　Abstract： In order to confirm the pathogen of peanut web blotch in Liaoning province， the pathogenicity of pure cultures separated from the disease samples was determined by Kirsch's rule， and the pathogenic bacteria were identified according to their morphological characteristics and ITS sequence analysis. The biological characteristics of pathogenic bacteria were studied by colony growth method and concave glass slide germination method. The results showed that the pathogen of peanut netted spot disease in Liaoning province was Peyronellaea arachidicola. The optimum temperature of mycelium growth was 23 ℃. The best carbon source was maltose， the best nitrogen source was yeast paste， the optimum pH was 7， the light dark alternation was beneficial to the mycelium growth and the mycelial lethal temperature was 45 ℃. The optimum temperature for conidia germination was 25 ℃， the optimum pH was 7， and the illumination condition was beneficial to conidial germination.
　　Key words： peanut（Arachis hypogaea Linn.）; peanut web blotch; Peyronellaea arachidicola; biological characteristics
　　花生（Arachis hypogaea Linn.）是重要的油料作物，其种植生产遍布全球100多个国家。中国是全世界重要的花生生产国，而辽宁省是国内重要的花生产区之一。辽宁省的花生素以品质好、黄曲霉毒素含量低著称，是省内最主要的油料作物。近年来，由于种植花生的经济效益日渐凸显，辽宁省的花生种植面积显著增加，成为辽宁省种植的第三大主栽作物和第一大油料作物，2017年辽宁省花生种植面积近40万hm2。随着花生种植面积不断扩大及部分主栽区常年连作，导致花生病害发生率连年上升[1]。其中花生网斑病是花生最为严重的叶部病害之一，可使花生减产10%～20%，病害发生严重时，重茬种植地块可减产30%，经济损失大，严重制约了辽宁省花生产业的良性发展[2]。
　　1972年花生网斑病在美国德克萨斯州首次被发现[3]。1982年该病害在中国的山东、辽宁等省花生主产区被首次发现，陕西省、河南省也相继发现了该病害。Marasas等[4]1974年研究南非发现的花生网斑病害时将花生网斑病的病原菌命名为花生茎点霉（Phoma arachidicola）。历史上，花生网斑病病原菌的属级分类地位相对混乱，至2010年，Aveskamp等[5]采用最新的分子生物学技术对茎点霉属的系统发育进行分析，将原茎点霉属下的派伦霉节升为派伦霉属，并将花生网斑病病原菌归到派伦霉属，由此，花生网斑病病原菌被命名为花生派伦霉（Peyronellaea arachidicola）。花生网斑病发病时，病原菌侵染叶片造成叶部病斑，严重影响叶片光合作用，随着病斑扩大可导致花生叶片干枯脱落，在花生的花期、结荚期、成熟期均可发病[6]。针对辽宁省花生网斑病的研究主要集中在品种抗性、化学防治、流行规律等方面，而对病原菌鉴定及生物学特性研究缺乏系统的报道[7-15]。因此，本试验从病原菌分离及生物学特性等方面进行系统研究，为辽宁省花生网斑病害综合防治提供一定理论依据。 　　1  材料与方法
　　1.1  花生网斑病病原菌分离
　　花生网斑病叶片采集于辽宁省农业科学院试验基地，参照方中达[16]的方法进行病菌分离，即在典型病斑的病健交界处剪取5 mm×5 mm大小的病叶组织，用乙醇和氯化汞进行表面消毒，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干后接种于PDA培养基上培养，培养温度25 ℃。经单孢分离后保存备用。
　　1.2  病原菌致病性测定
　　根据柯赫氏法则，对已纯化的菌株进行致病性测定。选取健康的花生叶片进行接种[17]。花生叶片用75%乙醇进行表面消毒，将单孢分离纯化的菌株转接到PDA平板上，25 ℃条件下培养10 d，制成5 mm菌饼接种于叶片上，以接种相同大小菌饼的PDA培养基作为对照。25 ℃保湿培养，每24 h观察接种部位症状，每处理重复10次。花生叶片发病时，再次从病健交界处分离病原物[18]。
　　1.3  病原菌分子生物学鉴定
　　将纯化的病原菌接种到液体培养基中，25 ℃条件下160 r/min振荡培养10 d，离心收集菌丝体进行冷冻干燥，-40 ℃保存备用。采用Aidlab真菌DNA快速提取试剂盒提取病原菌的基因组DNA，采用真菌rDNA ITS的通用引物ITS4、ITS5进行PCR扩增，引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。PCR反应条件：95 ℃预变性4 min;95 ℃变性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环;72 ℃延伸10 min。将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并将测序结果与GenBank中已知序列进行同源性比对[19-21]。
　　1.4  病原菌生物学特性测定
　　①PDA培养基：马铃薯200 g（去皮）、葡萄糖20 g、琼脂20 g、无菌水1 000 mL，pH 7.0;②Czapek培养基：硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂20 g、无菌水1 000 mL，pH 7.0;③OA培养基：燕麦粉15 g、琼脂10 g、无菌水1 000 mL，pH 7.0。
　　1.4.1  温度对病原菌生长的影响  将纯化好的菌株于PDA平板上培养5 d，用灭菌打孔器在菌落边缘取5 mm的菌饼，将菌饼接种到PDA平板中央，分别置于5、10、15、20、23、25、28、30、35 ℃条件下恒温培养[22]，每个处理3次重复。培养10 d后采用十字交叉法测量菌落直径。
　　1.4.2  不同碳、氮源对病原菌生长的影响  以Czapek培養基为基础培养基，用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、甘露醇、淀粉、核糖代替其中的蔗糖，测定不同碳源对花生网斑病菌生长的影响;用蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸铵、甘氨酸、牛肉膏、硫酸铵代替硝酸钠，测定不同氮源对花生网斑病菌生长的影响。用无菌的打孔器在活化菌落边缘取5 mm的菌饼接种于含有不同碳、氮源的培养基上，23 ℃恒温培养，每处理重复3次。培养10 d后采用十字交叉法测量菌落直径。
　　1.4.3  pH对病原菌生长的影响  用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液调节PDA培养基的pH，制成pH为4、5、6、7、8、9、10的PDA培养基平板，将5 mm菌饼接种于平板中央，23 ℃恒温培养，每处理重复3次。培养10 d后采用十字交叉法测量菌落直径。
　　1.4.4  光照对菌落生长的影响  将5 mm菌饼接种于PDA平板中央，置于连续光照、连续黑暗、12 h光照/12 h黑暗环境下25 ℃恒温培养，每处理重复3次。培养10 d后采用十字交叉法测量菌落直径。
　　1.4.5  菌丝致死温度测定  将5 mm菌饼置于装有无菌水的2 mL离心管中，置于40、45、50、55、60、65 ℃的水浴锅中，10 min后将菌饼取出，接种于PDA平板上，23 ℃恒温培养5 d，每处理重复3次，观察病原菌生长情况。
　　1.4.6  温度对分生孢子萌发的影响  将病原菌在OA平板上培养15 d，待其产生分生孢子器后，用无菌解剖刀刮取分生孢子器置于装有适量无菌水的50 mL烧杯中，静置20 min，使分生孢子器吸水胀破，释放分生孢子，后用无菌水配制成浓度为105个孢子/mL悬浮液备用。采用凹载玻片孢子萌发法，将孢子悬浮液分别置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃条件下，每隔1 h镜检萌发情况，测定萌发率，每处理重复3次。
　　1.4.7  pH对分生孢子萌发的影响  用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液将无菌水的pH调节成4、5、6、7、8、9、10共7个梯度，采用凹载玻片萌发法测定孢子萌发率，25 ℃条件下培养，每隔1 h镜检萌发情况，测定萌发率，每处理重复3次。
　　1.4.8  光照对分生孢子萌发的影响  采用凹载玻片孢子萌发法，将孢子悬浮液分别置于连续光照、连续黑暗、12 h光照/12 h黑暗环境下，每隔1 h镜检萌发情况，测定萌发率，每处理重复3次。
　　2  结果与分析
　　2.1  病症与致病性
　　花生网斑病主要为害花生叶片，其次为害叶柄和茎部。常在花期染病，先侵染叶片，初期沿主脉产生圆形至不规则形的黑褐色小斑，病斑周围有退绿晕圈，后期在叶片正面边缘呈现网纹状的不规则形褐色斑，且病部可见粟褐色小点，即病菌分生孢子器，不透过叶面。阴雨连绵时叶面病斑较大，近圆形（不规则），黑褐色;叶背病斑不明显，淡褐色，重者病斑融合。病部可见粟褐色小点，即病菌分生孢子器，干燥条件下病斑易破裂穿孔。 　　将从病斑上（图1a）分离纯化的菌株接种于健康的花生叶片上，在接种部位均出现花生网斑病病斑（图1b），对照植株不发病。从接种部位分离得到的菌株与接种菌株相同，因而分离所得菌株为花生网斑病病原菌。
　　2.2  花生网斑病病原菌鉴定
　　花生网斑病病原菌菌丝体在PDA培养基上菌落呈白色至灰白色（图2a），分生孢子无色，长椭圆形或哑铃形，多双胞，少数单胞，分生孢子大小为（12～20） μm×（3～4） μm（图2b）。孢子壳黑色，近球形，埋生或半埋生于病组织中，大小为50～200 μm（图2c）。
　　用ITS4&5对花生网斑病病原菌的ITS序列进行扩增，得到长度为569 bp的序列。经过BLAST分析，与GenBank中的Perronellaea（KC802087、MK 267758、KR012905）同源性高达98%～99%。
　　2.3  温度对花生网斑病病原菌生长的影响
　　由图3可知，花生网斑病病原菌菌丝在5～35 ℃均可生长，病原菌最适生长温度为23 ℃，菌落平均直径为53 mm，在23 ℃和25 ℃条件下病原菌的菌落平均直径显著高于其他温度下菌落平均直径。
　　2.4  不同碳、氮源对花生网斑病病原菌菌落生长的影响
　　由图4可知，花生网斑病病原菌生长最好的碳源为麦芽糖，病原菌在以葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、淀粉作为碳源的培养基中也能较好生长，生长较差的碳源为核糖。23 ℃条件下培养15 d，以麦芽糖为碳源的病原菌菌落平均直径为33 mm，显著高于以葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、淀粉、核糖为碳源的菌落平均直径，其中以核糖为碳源的病原菌菌落平均直径最小，为16 mm。
　　由图5可知，花生网斑病病原菌生长最好的氮源为酵母膏，病原菌在以蛋白胨、牛肉膏、甘氨酸作为氮源的培养基中也能较好生长，生长较差的氮源为硫酸銨。23 ℃条件下培养15 d，以酵母膏为氮源的病原菌菌落平均直径为56 mm，以蛋白胨为氮源的病原菌菌落平均直径为53 mm，显著高于以硝酸钠、尿素、硝酸铵、甘氨酸、牛肉膏、硫酸铵为氮源的菌落平均直径，其中以硫酸铵为氮源的病原菌菌落平均直径最小，为21 mm。
　　2.5  pH对花生网斑病病原菌菌落生长的影响
　　由图6可知，花生网斑病病原菌对酸碱度的适应范围广泛，在pH 4～10均可生长，pH为7时最适宜病原菌生长，菌落平均直径为54 mm，pH为6、7、8时病原菌的菌落平均直径显著高于其他pH的菌落平均直径。
　　2.6  光照对花生网斑病病原菌菌落生长的影响
　　由图7可知，在光暗交替条件下，花生网斑病病原菌菌落的生长速度最快，25 ℃条件下培养8 d，菌落平均直径为42 mm;全光照条件下菌落平均直径为40 mm，与光暗交替条件下差异不显著;全黑暗条件下菌落平均直径为36 mm，显著低于光暗交替和全光照条件下的菌落平均直径。
　　2.7  花生网斑病病原菌菌丝致死温度
　　花生网斑病病原菌菌丝在40 ℃水浴处理10 min后能在PDA培养基上继续生长，在45～65 ℃条件下水浴处理10 min后无法继续生长。在40、41、42、43、44、45 ℃ 6个温度梯度下，水浴处理10 min后，40～44 ℃条件下处理的菌丝均能在培养基上继续生长。因此，确定花生网斑病病原菌菌丝的致死温度为45 ℃。
　　2.8  温度对花生网斑病病原菌分生孢子萌发的影响
　　在5、10、15、20、25、30、35、40 ℃条件下，花生网斑病病原菌孢子的萌发率分别为0、12.67%、65.00%、76.00%、91.67%、83.33%、49.33%、0。
　　2.9  pH对花生网斑病病原菌分生孢子萌发的影响
　　花生网斑病病原菌分生孢子在pH为4、5、6、7、8、9、10时萌发率分别为30.67%、55.33%、75.00%、89.00%、70.67%、61.00%、22.00%。孢子萌发最适pH为7。
　　2.10  光照对花生网斑病病原菌分生孢子萌发的影响
　　花生网斑病病原菌孢子在24 h光照、12 h光暗交替、24 h黑暗条件下萌发率分别为86%、81%、67%。24 h光照条件下孢子萌发率最高，即光照对孢子萌发有一定的促进作用。
　　3  小结与讨论
　　ITS鉴定结果表明，实验室分离纯化的菌种为花生网斑病原菌。研究表明，花生网斑病菌菌丝在5～35 ℃条件下均可生长，最适生长温度为23 ℃。pH为4～10条件下菌丝均可生长，最适pH为7，最佳碳源为麦芽糖，最佳氮源为酵母膏，光照有利于菌丝生长。菌丝的致死温度为45 ℃。分生孢子在5～35 ℃条件下，pH在4～10的条件下均能萌发。分生孢子萌发的最适温度是25 ℃，最适pH为7，光照有利于分生孢子的萌发。辽宁省花生网斑病病原菌菌丝的生物学特性与许欣然等[14]针对河南省花生网斑病原菌的研究基本一致，在其研究基础上明确了分生孢子萌发的最适条件，并且在新的分类系统下对病原菌的ITS序列进行了分析。辽宁省花生网斑病发病高峰期为每年8月中旬至9月中旬，在花生收获前期发病尤为严重，而病原菌菌丝生长的最适温度是23 ℃，分生孢子萌发的最适温度是25 ℃，温度过高或过低都不利于菌丝生长及分生孢子的萌发，这与花生网斑病发病高峰期的温度一致。
　　近年来，针对该病害的研究主要集中在化学防治、流行规律及病原菌致病性差异等方面。朱茂山等[23]、吕宾等[24]对病原菌的化学防治进行了研究，明确了常用杀菌剂对该病害的室内毒力活性及田间防治效果。李绍建等[25]对该病原菌的致病力差异进行了研究，明确了不同病斑类型及其病原菌的致病力差异。Pettit等[26]、Smith等[27]明确了网斑病的越冬形式、初侵染来源和传播途径。周如军等[28，29]、崔建潮等[30]对辽宁省花生叶斑病流行时间动态、混合侵染、产量损失、品种抗性鉴定等方面开展了研究。花生在辽宁省的种植面积连年上升，然而针对花生网斑病的防治并不规范，田间用药主要以化学农药为主，长期单一使用化学农药致使病原菌产生抗性的风险显著提高，给花生网斑病的有效防治带来较大困难，同时也造成严重的环境污染问题，了解花生网斑病病原菌的生物学特性为下一步该病害的生物防治提供一定理论依据，同时为该病害的科学治理提供策略。 　　参考文献：
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　　收稿日期：2019-03-21
　　基金项目：农业部东北作物有害生物综合治理重点实验室开放基金项目（DB2018-6）
　　作者简介：谢瑾卉（1987-），女，辽宁沈阳人，助理研究员，硕士，主要从事植物病害及生物防治工作，（电话）13464002199（电子信箱）
　　seaside2008@yeah.net。
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