灰毡毛忍冬组培苗生根过程中内源生长调节剂的变化
来源:用户上传
作者:
摘要：以灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz）组培苗为试验材料，用双抗体一步夹心酶联免疫法测定灰毡毛忍冬生根诱导过程（0、6、12、18、24、30 d）中生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）含量的变化。结果表明，ABA含量呈先上升后下降的趋势;IAA、GA3和ZR含量均呈先下降后上升的趋势。IAA、GA3含量和IAA/ABA比值与生根率呈显著或极显著正相关，ABA含量与生根率呈负相关，ZR含量与生根率相关性不显著。
关键词：灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz）;组织培养;内源生长调节剂;生根诱导
中图分类号：S722.8;Q949.781.2 文献标识码：A
文章编号：0439-8114（2020）02-0110-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.023 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Changes of endogenous growth regulators during roots of tissue culture
seedlings of Lonicera macranthoides Hand.-Mazz
CAO Zheng-yan1，TANG Ning1，2，CHEN Ze-xiong1，2，LOU Juan1，2
（1.Institute of Special Plants，Chongqing University of Arts and Sciences，Chongqing 402160，China;
2.Collaborative Innovation Center of Special Plant Industry in Chongqing，Chongqing 402160，China）
Abstract： The tissue culture seedlings of Lonicera macranthoides Hand.-Mazz were used as experimental materials，the changes of the content of indole-3-acetic acid （IAA）， abscisic acid （ABA）， gibberellic acid （GA3）， and zeatin nucleoside （ZR） in the root-inducing process （0，6，12，18，24，30 d） were determined by the method of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. The results showed that the content of ABA was increased initially and then decreased. The concentrations of IAA， GA3 and ZR displayed the opposite trends， which were decreased firstly and subsequently increased. The contents of IAA and GA3 and the ratio of IAA to ABA were significant or extremely significant positively correlated with rooting rates， while ABA contents were negatively correlated with rooting rates， and there was no significant correlation between ZR content and rooting rate.
Key words： Lonicera macranthoides Hand.-Mazz; tissue culture; endogenous growth regulators; root induction
植物內源生长调节剂（Plant pytohormones）是植物体内自身合成并在低浓度（小于1 μmol/L）下就能调节植物自身生理过程的微量有机物质[1]，其不仅影响植物细胞的分裂、生长和分化，还影响植物的发芽和生根等[2]。
灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz）别名山银花，属于忍冬科忍冬属常绿藤本植物，具有清热解毒、抗菌消炎的功效，在中医临床及民间广泛应用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发病等疾病的治疗，是中国药典规定的名贵中药材之一[3]。灰毡毛忍冬是重庆武陵山区脱贫致富的重要载体，目前该药材繁殖主要采用人工扦插方式，但生根率极低。近年来，组织培养已成为灰毡毛忍冬苗木繁殖的重要方式之一，但其组培苗生根率不高的问题制约了种苗的规模化生产。研究表明，忍冬属的生根机制与其内源生长调节剂相关[4]，但目前尚未见灰毡毛忍冬组培苗生根过程中内源生长调节剂变化的研究报道。
本试验采用双抗体一步夹心酶联免疫法测定灰毡毛忍冬组培苗生根过程中内源生长调节剂的变化，并分析了生长调节剂变化与生根率的相关性，明确了灰毡毛忍冬的生根率与生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）的关联度，以期为外源生长调节剂在灰毡毛忍冬组培苗生根中的使用提供科学依据，为灰毡毛忍冬工厂化育苗提供技术指导。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 以灰毡毛忍冬渝蕾1号组培苗为试验材料，选取生长健壮、高度基本一致（4～5 cm）的继代苗（苗龄1个月）接种到生根培养基中（1/2MB+3.0 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA+100.0 mg/L活性炭），每瓶接种8株组培苗。培养温度为（25±1） ℃，光照时间为12 h/d，光照度为2 000～3 000 lx。分别于培养0、6、12、18、24、30 d后取样，以0 d为对照，每个取样处理重复3次，每次取样40株。
取样前统计组培苗的生根性状指标，包括生根率、茎段直径和平均根长。同时取距离培养基表面2 cm处的茎段于液氮中速冻保存，用于测定IAA、ABA、GA3、ZR的含量。
1.1.2 主要试剂及仪器
1）试剂：甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均为色谱纯;NaOH、HCl、PBS缓冲液等，均为国产分析纯。
2）仪器：德国IKA RV10旋转蒸发仪、美国MD SpectraMax iD3多功能酶标仪、湘仪H1650离心机、Eppendorf移液枪等。
1.2 试验方法
1.2.1 内源生长调节剂的提取 参照齐永平等[5]内源生长调节剂的提取方法，略有改变。称取1.00 g灰毡毛忍冬组培苗茎段，将每个茎段剪成小段，用液氮研磨成粉末，全部转移至10 mL离心管中。将4 ℃预冷的体积分数为80%的甲醇溶液加入匀浆中，冷浸（4 ℃）避光提取12 h离心，离心后取上清液，重复2次，将上清液混合。用旋转蒸发器将滤液减压蒸发（36～38 ℃）至原体积的1/2。加入2 mL石油醚提取部分色素，弃掉石油醚层，继续旋转蒸发至原体积的1/3，IAA、ABA、GA3、ZR存在于该水溶液中。用HCl将水溶液pH调至2.5～2.8，用等体积的乙酸乙酯萃取，使水相和乙酸乙酯相分离，重复上述步骤2次后合并乙酸乙酯相。此时水溶液可用于测定ZR的含量，ABA、GA3、IAA存在于乙酸乙酯相中。用NaOH将其pH调至8.0，再加入等体积的正丁醇溶液萃取2次，并将所有的正丁醇合并。再将乙酸乙酯相和正丁醇相分别在旋转蒸发仪上36～38 ℃减压蒸干。最后加入PBS缓冲液溶解定容至5 mL，置于4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 内源生长调节剂的测定 用酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（博海生物工程开发有限公司），在酶标板分别设置标准品孔、空白孔和样本孔，严格按照说明书操作，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD），计算样品浓度。
1.2.3 数据分析 采用SPSS 17.0统计软件对灰毡毛忍冬组培苗生根过程中的生根性状和各类生长调节剂含量进行方差分析和相关性分析。
2 结果与分析
2.1 灰毡毛忍冬组培苗不定根形成
试验结果发现，灰毡毛忍冬组培苗不定根的形成大致可划分为3个阶段（图1）：第一阶段为0～6 d，大部分灰毡毛忍冬组培苗产生愈伤组织;第二阶段为6～12 d，愈伤组织继续生长，不定根开始伸出;第三阶段为12～30 d，不定根继续伸长。
2.2 灰毡毛忍冬组培苗不同时期的生根性状
由表1可知，灰毡毛忍冬组培苗生根率随时间的推移而增加。培养前6 d灰毡毛忍冬生根率为0，6～12 d逐渐开始生根，12～24 d生根率变化最大，培养30 d时生根率达100.0%;灰毡毛忍冬生根过程中茎段直径变化无显著差异。对根的长度而言，随着培养时间的延长，灰毡毛忍冬组培苗平均根长逐渐增加，30 d时平均值最长为28.188 mm，且与其他时期的平均根长存在显著差异。
2.3 灰毡毛忍冬组培苗生根过程中的内源生长调节剂含量
2.3.1 灰毡毛忍冬组培苗生根过程中内源IAA含量的变化 由图2可知，灰毡毛忍冬组培苗生根过程中IAA含量呈先下降后上升的趋势。6 d时，IAA含量最低，为14.928 ng/g;30 d时，IAA含量最高，为16.120 ng/g。在0～30 d的培养过程中，灰毡毛忍冬组培苗内源IAA含量无显著差异。
2.3.2 灰毡毛忍冬组培苗生根过程中内源ABA含量的变化 由图3可知，灰毡毛忍冬组培苗生根过程中内源ABA的含量呈上升-降低-上升的趋势。开始生根培养时，ABA含量达24.106 ng/g，随着培养时间的延长含量逐漸增加，在6 d时含量达到最高，为27.876 ng/g，且与18、24、30 d的含量存在显著差异。自6 d以后ABA含量一直随着生根天数的增加而递减，在24 d时，ABA含量最低，为18.646 ng/g。12、18、24、30 d的ABA含量无显著差异。
2.3.3 灰毡毛忍冬组培苗生根过程中内源GA3含量的变化 如图4所示，0～6 d为灰毡毛忍冬组培苗愈伤组织的产生阶段，此阶段GA3含量在下降，但2个时间点含量间差异不显著，随后灰毡毛忍冬组培苗GA3含量随时间延长呈上升趋势，即GA3含量在愈伤组织的诱导时期和不定根的形成及伸长时期呈上升趋势。12、18、24 d的GA3含量差异不显著，但培养30 d后的GA3含量与0、6 d的GA3含量均存在显著差异。
2.3.4 灰毡毛忍冬组培苗生根过程中内源ZR含量的变化 由图5可知，灰毡毛忍冬组培苗ZR含量变化呈不规则的形状，开始培养时ZR含量最高，达1.794 ng/g，随着培养时间的延长含量逐渐下降，12 d时ZR含量为最低，为1.712 ng/g;随后ZR含量逐渐升高，30 d时的含量为1.762 ng/g。整个生根过程中各时期之间ZR含量差异不显著。 2.3.5 灰毡毛忍冬组培苗生根过程中IAA/ABA比值的变化 灰毡毛忍冬组培苗生根过程中IAA/ABA比值的变化如图6所示。IAA/ABA比值从开始培养一直下降，6 d时下降到最低，仅为0.536，然后逐渐上升，尤其是6～12 d期间上升速度很快，24 d时上升到最高，为0.851，继续培养至30 d，其比值稍有下降。
2.4 灰毡毛忍冬组培苗生根过程中内源生长调节剂与生根率的相关性分析
由表2可知，灰毡毛忍冬的生根率与茎段的内源生长调节剂变化密切相关。灰毡毛忍冬的生根率与茎段的IAA含量、IAA/ABA比值及GA3含量均呈正相关，相关系数分别为0.870、0.845、0.925，相关度较高;灰毡毛忍冬的生根率与茎段的ABA含量相关系数为-0.780，因此二者呈负相关;茎段的ZR含量与灰毡毛忍冬组培苗的生根率相关性不高。
3 讨论与结论
3.1 讨论
3.1.1 IAA对生根率的影响 IAA的含量在植物不定根的伸长过程中起重要的促进作用，即IAA能促进植物细胞分裂，诱导植物愈伤组织的产生，对植物根的形成有促进作用[6，7]。灰毡毛忍冬组培苗开始培养时IAA含量下降，这可能是组培苗在生根初期受到切伤所导致的。从6 d开始上升，直到生根18 d时不定根的发生伴随着IAA含量达到峰值，这可能是在灰毡毛忍冬组培苗生根过程中积累的高浓度IAA对不定根的萌发产生了促进作用。18 d以后IAA含量先降低后升高，可能是根的伸长消耗了部分内源IAA，后又因为新根生出后植株自身合成了内源IAA，从而使总的IAA含量上升。
3.1.2 ABA对生根率的影响 ABA有利于植株体内营养物质的积累运输，是植物体内天然的抑制性植物生长调节剂，对植物的生根非常重要[8]。在灰毡毛忍冬组培苗生根初期，可能是由于离体切割刺激ABA的形成使组培苗内的ABA含量上升，6～24 d都呈降低趋势，所以愈伤组织和不定根的形成都与低的ABA含量有关，但生根24 d后，ABA含量又呈上升趋势，可能是由于组培苗到生根后期植株所在的培养基里的养分不足，不能为植株的生长提供营养，长势开始变缓，促使ABA含量上升。
3.1.3 GA3对生根率的影响 一般认为GA3对细胞分裂和伸长具有促进作用[9]，笔者认为GA3的含量与生根苗的生根率呈正相关，这与张雪等[4]的研究结论一致，可能是GA3含量的增加，增强了植株蛋白质和淀粉等有机物的水解，因而促进了植株不定根的生成。但其他研究结果显示，GA3是不定根形成的抑制剂[10]，这可能与物种相关，有待进一步探讨。
3.1.4 ZR对生根率的影响 结果表明，灰毡毛忍冬组培苗生根诱导0～12 d，ZR的含量呈现下降趋势。这是组培苗愈伤组织和不定根的形成时期，12 d时不定根已经形成，由此推断低浓度的ZR对生根起到了一定的促进作用，这与姚锐[11]对北美香柏的研究结果相一致，但整个生根培养期间，ZR的含量差异不显著。
3.1.5 IAA/ABA比值对生根率的影响 生长调节剂IAA对植物生根的作用具有两重性，在一定的浓度范围内能促进根细胞核和器官的伸长，但IAA的抑制作用也会伴随着浓度进一步增加而产生;而生长调节剂ABA是通过抑制生长调节剂IAA向发生作用部位的运输和植株离体器官的生长进而抑制不定根的形成[12]。ABA和IAA的含量变化呈相反的趋势，即在根源基启动（6 d）时IAA含量降到最低，而ABA上升到最高，这种趋势与董宁光等[13]、何崇单等[14]的观点基本一致。尽管两者的相关性和趋势不同，但IAA/ABA比值的大小在不同生根时期具有不同的促进作用。由此可以认为，只有当其比例达到一定的平衡时才对植株的生根有利，这与前人的研究结论相同[15]。
3.2 结论
灰毡毛忍冬组培苗生根过程中IAA含量呈先下降后上升的趋势;ABA含量呈先上升后下降的趋势;GA3和ZR含量都呈先下降后上升的趋势;IAA/ABA比值变化为下降-上升的趋势。IAA、GA3含量和IAA/ABA比值与生根率呈正相关，ABA含量与生根率呈负相关，ZR含量与生根率相关性较低。
参考文献：
[1] 李 华，郭启高，梁国鲁，等.利用高效液相色谱法同时测定枇杷果实中10种植物激素[J].西南大学学報（自然科学版），2018， 40（3）：18-25.
[2] DAVIES P J. The plant hormones：Their nature，occurrence，and functions[A].DAVIES P J.Plant hormones：Biosynthesis，signal transduction，action[M].Germany：Springer，Dordrecht，2010.1-15.
[3] CHEN Z X，TANG N，YOU Y M，et al. Transcriptome analysis reveals the mechanism underlying the production of a high quantity of chlorogenic acid in young leaves of Lonicera macranthoides Hand.-Mazz[J].PLoS One，2015，10（9）：e0137212.
[4] 张 雪，李隆云，杨 宪.灰毡毛忍冬扦插繁殖过程中内源激素含量变化[J].中药材，2012，35（4）：21-23. [5] 齐永平，顾 蔚，罗 成，等.华中五味子种子的发育和3种內源激素的变化[J].植物生理学通迅，2009，45（6）：615-618.
[6] AGULLO-ANTON M A，FERRANDEZ-AYELA A，FERNANDEZ-GARCIA N，et al. Early steps of adventitious rooting：Morphology，hormonal profiling and carbohydrate turnover in carnation stem cuttings[J].Physiologia plant，2014，150（3）：446-462.
[7] 闫文涛，佟兆庆，魏 俊，等.不同生长调节剂对蒙古栎嫩枝扦插生根的影响[J].西北林学院学报，2017，32（3）：116-121.
[8] 佟兆庆.卫矛嫩枝扦插繁殖技术和生根机理的研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2017.
[9] 蔡喜彦.细柄蕈树扦插繁殖及生根机理研究[D].南京：南京林业大学，2013.
[10] 欧阳芳群，付国赞，王军辉，等.欧洲云杉扦插生根进程中内源激素和多酚类物质变化[J].林业科学，2015，51（3）：155-162.
[11] 姚 锐.北美香柏扦插繁殖技术及其生根生理生化机理的研究[D].长沙：中南林业科技大学，2017.
[12] MCADAM S A M，BRODRIBB T J，ROSS J J. Shoot-derived abscisic acid promotes root growth[J].Plant cell and enviroment，2015，39（3）：652-659.
[13] 董宁光，齐建勋，陳永浩，等.沙藏埋枝处理对促进平欧杂种榛绿枝扦插生根的机制分析[J].果树学报，2016（12）：1510-1516.
[14] 何崇单，姚 锐，黄瑞春，等.外源K-IBA对北美香柏扦插生根和内源激素含量变化的影响[J].中南林业科技大学学报，2017， 37（10）：7-12.
[15] 吴小龙.泰山椴扦插繁殖技术及其生根机理的研究[D].山东泰安：山东农业大学，2016.
收稿日期：2019-03-20
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31770338）;重庆市科学技术局基础科学与前沿研究重点项目（cstc2017jcyjBX0026）
作者简介：曹正艳（1998-），女，重庆人，在读本科生，研究方向为植物次生代谢，（电话）15023401291（电子信箱）1583913991@qq.com;通信作者，
娄 娟（1981-），女，河南新乡人，教授，硕士，主要从事植物景观及应用研究，（电话）15922731580（电子信箱）165402500@qq.com。
转载注明来源:https://www.xzbu.com/8/view-15193115.htm
