柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定

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　　 柑橘属于国内第一大类水果品种，它的销量大且种植面积广。近年来，随着柑橘种植规模的持续扩大的同时，也带来了严重的病虫害困扰，其中隐患较大的当属柑橘黄龙病。柑橘黄龙病是柑橘生产中一直无法根治的大难题，给世界柑橘产业带来了毁灭性危害。故此，也被称为“柑橘癌症”，可侵染各种柑橘类及其近缘属作物。柳州市地处亚热带，有着丰富的柑橘品种和柑橘果园。本文实验材料来自于广西柳州市柑橘果园，选择了广西柳州市砂糖橘、温州柑、南丰蜜桔、甜橙等四种感病柑橘品种进行黄龙病叶片的采集、处理。本试验应用了CTAB法进行柑橘叶片的DNA提取以及荧光定量PCR检测技术对叶片感病情况进行检测。
　　一、柑橘黄龙病的田间调查
　　自2018年12月起，根据黄龙病的发病规律对柳州市柑橘果园的砂糖橘、温州柑、南丰蜜桔、甜橙、沃柑、桔柚等主要品种出现的黄龙病疑似症状进行全面调查和分析，病害症状主要表现为叶片黄化、斑驳，出现“红鼻子果”，以及果实口感酸涩等。根据病树表现出的叶片、果实、枝干的表型特征，在田间进行初步诊断。根据黄龙病病菌主要集中在叶片中脉的特点，我们对树龄相近、生长时期相近的柑橘病叶进行了采集。采摘有斑驳状或类似黄龙病症状的枝叶，放入采样袋中密封，用水洗净灰尘拍照整理，带回实验室置于-80℃冰箱保存备用。
　　二、CTAB法提取柑橘黄龙病叶片DNA
　　手术剪用酒精灯消毒后分别取其主叶脉约100mg，加入液氮充分研磨至粉末状，将粉末用EP管装好置于-80℃冰箱保存备用。自行配制CTAB提取液。从柳州果园共采南丰蜜桔、甜橙、温州柑、砂糖橘四个品种共50株，用CTAB法提取50个样本的DNA并用超微量紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度确保DNA浓度适宜做QPCR鉴定。
　　三、对黄龙病疑似症状采样进行QPCR分子检测确诊
　　以筛选出的感病植株GG14作为阳性对照，对50个DNA样品进行QPCR鉴定。定量PCR检测方法的灵敏度等级非常高，在确保柑橘样品DNA的纯度和浓度的情况下，对比常规PCR灵敏度低的特点，可以优先考虑使用定量PCR。应用该技术对来自柳州柑橘果园的显症叶片进行实际检测，检测结果与田间诊断结果情况一致，表明本荧光定量PCR检测方法可作为柑橘黄龙病早期诊断的灵敏、可靠、快速的检测手段。QPCR结果如下：
　　四、基于GC-MS的柑橘叶片代谢物鉴定
　　取柑橘整叶片加液氮研磨成粉末，精确称量50mg柑橘叶片样品;放入2mL的离心管中;加入500？l提取液（甲醇：水=4：1）于样品中;加入一颗钢珠，低温下高通量组织破碎仪破碎（50Hz，3min）;加入200uL氯仿，低温下，高通量组织破碎仪破碎;（50Hz，3min）;涡旋混匀后，冰水浴超声萃取30min;将样品静置于-20℃，30min;离心20min（12000rcf，4℃），取上清液装入玻璃衍生瓶中，真空抽干;向玻璃衍生小瓶中加入80？L的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液（15mg/mL），涡旋震荡2min后，于震荡培养箱中37°C中90min進行肟化反应;将样本取出后再加入80？LBSTFA（含1%TMCS）衍生试剂和20？L的正己烷，涡旋震荡2min后，于70℃反应60min;取出样本后，在室温放置30min，进行GC-MS代谢组学分析。
　　50组柑橘样品代谢物定性结果如表2所示：
　　五、柑橘黄龙病的防治对策
　　到目前为止，黄龙病致病菌在离体条件下依然难以培养，基因改良育种的方式不能大规模普及应用，有待学者们更进一步的研究;对柑橘苗木脱毒处理能够使病情有效延缓，但是从长远看，柑橘苗木自身抵抗感染的能力并没有增强。所以从源头上不是能真正抑制病菌的方法;生物防治需要投入大量的时间、人力、物力，成本很高且见效时间长，也不宜广泛采用;化学防治虽然见效快、能有效杀死黄龙病的传播媒介—木虱，但同时也危害了自然环境，建议在柑橘园有效使用防虫网，可以阻止病害虫传播。虽然简单、有效地隔离柑橘木虱等传播媒介病害虫，从而抑制黄龙病的发生。也可以利用昆虫的趋性，设置诱捕器等杀死黄龙病的传播媒介害虫。
　　 （作者单位：530004 广西大学）
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