葱粗提取液对甘蓝枯萎病菌的抑制效果初探

来源:用户上传      作者:鲁韵　王一凡　李二峰

　　 摘要：为探究葱粗提取液对甘蓝枯萎病菌尖孢镰刀菌的抑制效果，本试验设置不同浓度葱粗提取液，研究其对尖孢镰刀菌生长速率、孢子产量、孢子萌发率、菌丝结构的影响，并进行甘蓝枯萎病盆栽防效试验。结果表明：葱粗提取液对尖孢镰刀菌生长有显著的抑制作用。当PDA培养基中葱粗提取液浓度为0.6 g/mL时，抑菌率可达56.3%;培养基中葱提取液浓度为0.4 g/mL时，尖孢镰刀菌孢子产量抑制率和孢子萌发抑制率分别达到97.7%、92.1%;显微镜观察显示，葱粗提取液浓度越大，对尖孢镰刀菌菌丝形态结构影响越大。盆栽防效试验结果表明，当土壤中葱粗提取液浓度为0.043 g/g土时，接种7 d后的防治效果可达到65.9%。
　　关键词：甘蓝枯萎病; 尖孢镰刀菌; 葱粗提取液; 抑菌效果
　　中图分类号：S436.35 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2020）04-0136-05
　　Abstract In order to investigate the inhibitory effect of crude extracts from shallot on Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans （Foc）， different concentrations of shallot crude extracts were set to explore their influences on growth rate， spore yield， spore germination rate and hyphae structure of Foc， and the pot experiment was also conducted to determine their control efficiency. The results showed that the crude extracts of shallot had significant inhibitory effect on the growth of Foc. When the concentration of shallot crude extracts was 0.6 g/mL in PDA medium， the inhibitory rate was 56.3%. When the concentration of shallot crude extract was 0.4 g/mL， the inhibitory rate on spore yield and germination was 97.7% and 92.1%， respectively. Meanwhile， the morphological structure of mycelia was also changed as the concentration of shallot crude extracts increased. In the pot experiment， when the concentration of shallot crude extracts was 0.043 g per gram soil， the control effeciency reached 65.9% after inoculation for seven days.
　　Keywords Cabbage fusarium wilt; Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans; Crude extract of shallot; Inhibitory effect
　　 甘蓝是一种十字花科芸苔属蔬菜，是我国重要的蔬菜之一[1]。甘蓝枯萎病是由粘团专化型尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans， Foc）引起的土传病害，一般通过雨水、土壤、灌溉和农具等途径传播[2-5]。该病害被誉为“植物界的癌症”，防治较为困难，一旦发生，将会严重影响甘蓝产量，给农户带来巨大经济损失。
　　 目前，植物病害防治研究的热点之一为开发植物源杀菌剂。该类杀菌剂是利用具有杀菌、抑菌活性的某些植物部位，从中提取有效成分或分离纯化单体物质加工而成的防治药剂[6]。开发利用该类杀菌剂不仅对环境友好、人畜无毒，同时也为解决病原菌抗药性提供了很大可能[7]。已有很多报道证实植物提取液以及分泌物能有效地抵御病原菌侵染[8]，如葱汁液以及葡萄叶提取物可抑制茄子黄萎病菌（Verticillium dahliae）[9];荨麻、曼陀罗、马桑及商陆提取液可抑制核桃黑斑病伴生病原菌成团泛菌（Pantoea agglomerans）[10];银杏、马尾松提取物可以抑制青枯病菌（Ralstonia solanacearum）[11];洋葱鳞茎粗提物可以抑制苹果轮纹病菌（Physalospora piricola Nose）[12]。在枯萎病防治领域，该类相关研究也陆续开展，如：高浓度的蒜根系分泌物对石榴枯萎病菌（Ceratocystis fimbriata）的菌丝生长有明显抑制作用[13];蒜和葱提取物对香蕉枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cubense）的菌落生长有明显抑制作用[14];韭菜粗提取物对香蕉枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发有明显抑制作用，可使病原菌菌丝结构发生变化，同时对孢子有致死作用[7];西芹鲜根浸提液对黄瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cucumeris）的孢子产量和孢子萌发有明显抑制作用，对其菌丝形态也有影响[15]。
　　 目前，甘蓝枯萎病的主要防治方法有抗病育种法、轮作换茬法以及化学药剂防治法等[16]，有关植物粗提取液对该病害抑制效果的报道较少[17]。自2001年北京市延庆地区报道甘蓝枯萎病发生后，该病害在我国有逐年加重的趋势[18，19]，因此，尋找该病害的新防治方法迫在眉睫。本试验研究了不同浓度大葱粗提取液对甘蓝枯萎病菌的抑制效果，以期为开发新的植物源农药提供参考，并为甘蓝枯萎病的绿色防控提供新思路和新方法。 　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　 供试菌株：尖孢镰刀菌（F.oxysporum f.sp. conglutinans），由中国农业科学院蔬菜花卉研究所真菌病害课题组提供。
　　抑菌试验所用葱粗提取液：取鲜葱200 g，洗净晾干后切成5 cm小段，加100 mL蒸馏水，用榨汁机打碎，装入离心管;13 000 r/min离心10 min，离心4次，直至上清液透明;用0.22 μm细菌过滤器过滤上清液，将滤液调整为2 g/mL的水提原液，4℃保存备用[5]。
　　 盆栽防效试验所用葱粗提取液：取鲜葱200 g，洗净晾干后切成5 cm小段，加1 000 mL蒸馏水，用榨汁机打碎，调整为0.2 g/mL浓度的水提原液，备用。
　　1.2 葱粗提取液对尖孢镰刀菌生长速率的影响
　　 参照文献[5，7]的方法，分别取0、2、4、6 mL的葱粗提取液至培养皿中（Φ=9 cm），将冷却至37℃左右的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）倒入上述培养皿中，每皿20 mL，混匀，配制成含有粗提取液浓度分别为0、0.2、0.4、0.6 g/mL的培养基;取培养5 d的甘蓝枯萎病菌平板，用直径0.8 cm打孔器打成大小一致的菌饼，接种于上述培养基中，分别记为CK、T1、T2、T3处理，每处理重复3皿。将培养皿置于28℃培养箱中培养7 d，采用十字交叉法测量菌落直径，观察菌落形态、菌丝生长状况，比较其生长速率。
　　 净生长量（cm）=菌落直径-菌饼直径;
　　 抑菌率（%）=（对照菌落净生长量-处理菌落净生长量）/对照菌落净生长量×100。
　　1.3 葱粗提取液对尖孢镰刀菌分生孢子产量的影响
　　 将尖孢镰刀菌接种在马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基中，置于180 r/min、28℃振荡培养3 d，离心收集孢子，再用无菌去离子水冲洗3次，将孢子悬浮液稀释为每毫升 1×106个，备用。取0、10、20、30 mL葱粗提取液，分别加入70 mL PDB培养基，用无菌水补充体积至100 mL，得到含有葱粗提取液浓度分别为0、0.2、0.4、0.6 g/mL的培养基，分别加入1 mL孢子悬浮液，记为CK、T1、T2、T3处理，每处理重复3瓶。置于180 r/min、28℃振荡培养7 d后过滤分生孢子。显微镜下观察分生孢子的生长情况，并用血球计数板计算孢子浓度。
　　1.4 葱粗提取液对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响
　　 孢子收集方法同1.3，将收集好的孢子用PDB培养基稀释至孢子浓度为每毫升1×107个，分别取200 μL加至盛有500 μL PDB培养基的2.0 mL离心管中，各加入0、50、100、200 μL葱粗提取液，最后用无菌水补充总体积为1 mL，此时不同离心管中葱粗提取液浓度分别为0、0.1、0.2、0.4 g/mL，记为CK、T1、T2、T3处理，每处理重复3管。将各处理置于28℃、180 r/min振荡培养24 h后，用普通光学电镜观察孢子萌发情况，每重复取样观察3次，每次观察约100个孢子[2]。
　　 孢子萌发率（%）= （萌发孢子总数/观察孢子总数）×100;
　　 孢子萌发抑制率（%）=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100。
　　1.5 葱粗提取液对甘蓝枯萎病的盆栽防效试验
　　 分别取 0、15、30、60 mL的葱粗提取液与70 g土壤混匀，装入苗钵中，此时土壤中葱粗提取液浓度分别为 0、0.043、0.086、0.172 g/g土，记为CK、T1、T2、T3处理;将三叶一心期的甘蓝幼苗在浓度为每毫升1×107个甘蓝枯萎病菌孢子的悬浮液中浸泡20 min，移栽到上述苗钵中。每处理重复3次，每重复15～20 株甘蓝幼苗。光照培养箱中28℃培养7 d后调查植株发病情况，并根据病情分级标准，计算病情指数。
　　 分级标准：0 级，无症状;1 级，1 片叶轻微变黄;2 级，1～2 片叶叶脉轻至中度变黄：3 级，除心叶外，其余叶片中度变黄萎蔫;4 级，全部叶片重度变黄或萎蔫;5 级，叶片完全萎蔫并变黄。
　　 病情指数 =Σ（各级发病数 × 各级代表值）/（处理总数 × 最高级代表值）×100;
　　 防效（%）=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100。
　　1.6 数据处理
　　 利用Microsoft Excel 2013软件进行数据统计及作图，SPSS 19.00软件进行方差分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同浓度葱粗提取液对尖孢镰刀菌生长速率的影响
　　 由图1可以看出，随着培养基中葱粗提取液浓度的增大，尖孢镰刀菌的菌落直径变小。培养7 d时，CK的菌落直径为8.8 cm，T1、T2、T3处理的菌落直径分别为5.5、5.1、4.3 cm，均顯著低于CK，抑菌率分别为41.3%、46.3%和56.3%。表明葱粗提取液对甘蓝枯萎病菌直径有明显的抑制作用，葱粗提取液浓度越高，抑制作用越明显。
　　2.2 不同浓度葱粗提取液对尖孢镰刀菌孢子产量的影响
　　 由图2可以看出，T1、T2、T3处理的尖孢镰刀菌孢子浓度分别为每毫升13.83×106、0.85×106、0.22×106个，对应孢子产量抑制率分别为62.0%、97.7%、99.4%，与CK相比，孢子产量均显著下降。表明，葱粗提取液对甘蓝枯萎病菌的孢子产量有显著的抑制作用，浓度越大，抑制作用越明显。
　　2.3 不同浓度葱粗提取液对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响
　　 经观察，T1、T2处理的孢子虽有萌发，但萌发出的菌丝长度明显短于CK，并且随着葱粗提取液浓度的增大，孢子萌发出的菌丝长度变短;T3处理的孢子不萌发，未观察到菌丝。培养24 h后，T2处理的孢子萌发率为 75.5%，显著低于CK，T3处理的孢子萌发率仅为7.1%，抑制率高达92.1%，与CK差异显著（图3）。表明，葱粗提取液对甘蓝枯萎病菌的孢子萌发有明显的抑制作用，浓度越大，抑制作用越明显。 　　2.4 葱粗提取液对菌丝形态的影响
　　 通过显微镜观察，不同浓度葱粗提取液的培养基中，甘蓝枯萎病菌的菌丝形态发生明显变化。未经葱粗提取液处理的菌丝表面光滑，有隔膜;葱粗提取液处理浓度为0.2、0.4 g/mL时，菌丝变细，部分变形扭曲甚至萎缩，同时可观察到菌丝隔膜减少;当培养基中葱粗提取液浓度为0.6 g/mL时，视野下未见正常形态的菌丝结构，菌丝已经发生裂解，甚至部分孢子不萌发，直接裂解或成片状。
　　2.5 葱粗提取液对甘蓝枯萎病的盆栽防效试验结果
　　 由图4可以看出，土壤中加入不同浓度葱粗提取液对甘蓝枯萎病的发生有一定防效，当葱粗提取液浓度为0.043 g/g土时，防效最好。
　　 由表1可以看出，接种7 d后，CK的甘蓝幼苗病情指数达到59.7， T1处理的甘蓝幼苗病情指数显著低于CK，为20.3，防治效果达到65.9%。T2、T3处理的甘蓝幼苗病情指数和防治效果分別为51.0和55.7、14.6%和6.7%，与CK相比防效不显著。
　　3 讨论与结论
　　 本试验得出，葱粗提取液对甘蓝枯萎病菌尖孢镰刀菌有明显抑制作用，表现在菌落生长速率降低、孢子产量下降、孢子萌发率降低、菌丝结构发生改变甚至消解;并且葱粗提取液浓度越大，抑制效果越强。但在盆栽防效试验中，低浓度的葱粗提取液防效最好，高浓度的提取液可能对甘蓝本身有一定刺激作用，导致其生长势减弱，更容易发生病害，因而防效不显著。这与杜黎黎[20]利用不同浓度分蘖洋葱鳞茎粗提液防治西瓜枯萎病的研究结果相似，均得出植物提取物浓度越高时，防效并未达到最好，反而某个较低浓度下的病害防治效果最好。
　　 随着人们对环境保护和自身健康需求的日益增长，开发绿色、环保、安全、高效的植物病害防控试剂将成为未来植物保护发展的必然趋势。生物防治相对于化学防治而言更为安全环保，相对于抗病品种选育而言更为快速[7]。其中植物源杀菌剂较化学药剂拥有更好的降解和应用前景[10]。本试验结果为甘蓝枯萎病防治提供了新方向，并为开发优质环保的植物源农药提供参考。
　　参 考 文 献：
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