循环miRNA监测肝细胞癌的研究

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　　摘要：肝癌是目前临床上最常见的恶性肿瘤之一，其早期诊断的困难导致了后期治疗的不理想化，因此肝癌的死亡率常年居高不下。现有的研究结果显示，多种miRNA的表达在正常人群和肝癌患者群体的组织甚至体液中的表达量有很大的差异。miRNA可能在肝脏肿瘤的发生发展中起到了至关重要的作用。本文就肝脏的生理功能、肝细胞癌的发生发展、常规诊断、miRNA与肝癌的关系等方面的研究作一综述。
　　关键词：肝癌;miRNA;早期诊断
　　中图分类号：R735.7                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.08.016
　　文章编号：1006-1959（2019）08-0048-05
　　Abstract：Liver cancer is one of the most common malignant tumors in the clinic. The difficulty in early diagnosis leads to the unsatisfactory treatment in the later stage. Therefore， the mortality of liver cancer is always high. The existing research results show that the expression levels of various miRNA are significantly different in the tissues and even body fluids of normal populations and liver cancer patient populations. miRNA may play a crucial role in the development of liver tumors. This article reviews the physiological functions of the liver， the development of hepatocellular carcinoma， routine diagnosis， and the relationship between miRNA and liver cancer.
　　Key words：Liver cancer;microRNA;Early diagnosis
　　肝臟疾病会影响人体的多种生理机能，其中最严重的肝脏疾病以肝细胞癌为代表。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的恶性肉瘤，它是原发性肝细胞癌的最常见形式，也是癌症相关死亡和发病的主要原因之一。大多数肝细胞癌病例与慢性肝硬一起发展。但是，慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者甚至在不经过肝硬化阶段的情况下发生HCC的风险也很高。由此看来，对风险人群的筛查和监测对于HCC管理至关重要。而且晚期HCC预后不良且有效治疗的选择方案很少。目前，只有甲胎蛋白（AFP）常规用作临床实验室中的循环HCC标志物，但是其灵敏度和特异性是十分有限的。因此，寻找可用于早期检测HCC的新颖且可靠的生物标志物迫在眉睫。微小RNA（miRNA）是一类长度约22个核苷酸的单链非编码细胞RNA。动物中的miRNA通常通过不完全碱基配对与靶基因的3'非编码区（3'UTR）结合来调节靶基因的表达，从而诱导降解或翻译抑制，实现在转录后水平调节靶基因的表达。miRNA已被证明与HCC的形成有关，这是支持其作为治疗靶点或疾病生物标志物的潜力点。本文就肝脏的生理功能、肝细胞癌的发生发展、常规诊断、miRNA与肝癌的关系等方面的研究作一综述。
　　1肝脏的生理功能
　　肝脏是人体内最大的器官，其重量约占体重的1/20。它具有多项重要的生理功能，比如内分泌和外分泌功能。肝脏的内分泌功能支持分泌多种激素，包括胰岛素样生长因子、血管紧张肽原、促血小板生成素。肝脏的外分泌功能主要指其分泌胆汁的能力。除此之外，肝脏的代谢功能同样不容忽视，它不仅操控着糖酵解和尿素代谢，血液的解毒功能以及体内的胆固醇水平同样受其调控，同时它还能够支持造血系统和消化系统的运转[1]。肝脏在糖原储存、药物解毒和多种血浆蛋白（包括白蛋白和载脂蛋白）的分泌等方面都起着至关重要的作用。
　　肝小叶是肝脏的功能性组织单位，它由多角形肝细胞索环绕中央静脉（肝门静脉的终末分支）排布而成。组成肝小叶的细胞类型有多种，其中包括肝细胞、胆管细胞、内皮细胞、星状细胞和库普弗细胞[1]。
　　肝细胞是肝脏的主要实质细胞，大约占肝脏总质量的80%。肝细胞为多面立方体形，可分泌血清白蛋白、胆汁以及一些重要的凝血因子。排列于胆管上的内皮细胞被称为胆管细胞，此处主要指肝内胆管，但值得注意的是胆管细胞行使其功能时遍及整个胆道系统[1]。星状细胞位于Disse腔中，构成了肝脏的主要间充质成分。在静息状态下，是维生素A的主要储库。当肝脏受损或感染时，星状细胞被激活，并转化为表达α平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞样细胞，这种细胞能够沉积细胞外基质并指导暂时性的纤维化瘢痕形成。另外，星状细胞还能调控肝脏的血管发育，能在静息状态下行使周细胞功能。库普弗细胞（KCs）是存在于血窦内的肝巨噬细胞，占肝总细胞的15%。在肝脏再生功能中，KCs通过影响肝祖细胞的侵袭能力发挥重要作用。 　　总之，肝脏是人体正常生理过程中一个如此重要的调节器，故而肝脏疾病（如乙肝、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌）的发病率和死亡率都相当高。由此引发的沉重的经济负担和健康危机，促使人们在对控制肝细胞分化和功能等基本发育机制的理解方面有了更深的渴求。
　　2 HCC的发生发展
　　HCC是全球癌症致死的第2大病因。自2010年起，美国的肝癌总患病率呈持续快速增长模式，目前虽然在HCC的诊断和治疗方面的研究工作有了一定的进展，但是临床上可以通过手术进行切除的肿瘤所占的比例仍然很低，且术后复发率高。在HCC的各种治疗措施中，肝移植术通常能够为患者带来佳音。过去的30年中，肝移植术的进步促使被诊断为局部肿瘤的患者在肝癌的幸存者中占有绝对优势[2]。然而，这对于那些被诊断出有转移瘤块的患者而言毫无意义[3]，并且其高昂的经济代价注定了它仅能造福于少数患者。总的来说，各项不利因素最终导致肝癌患者的总生存率低至18%[2]。
　　HCC的发展受到包括遗传和环境在内的多重因素的影响，因此，个体肿瘤往往表现出很大程度上的异质性。具体来说，HCC是在肝硬化的基础上发展而来的。此外，乙型肝炎病毒（HBV）[4]、丙型肝炎病毒（HCV）[5]、接触来自曲霉属的黄曲霉毒素B1、酗酒以及非酒精性脂肪性肝炎[6]等因素都進一步促进了肿瘤的生成。就地域特征而言，HCC是一个世界范围内的疾病，然而在东南亚和撒哈拉以南的非洲，由于HBV感染和接触受污染谷物中的黄曲霉毒素B1等原因，其发病率尤其高。此外，由于慢性HCV感染，西方国家的HCC患病率也在逐年增长[7]。
　　一般来说，HCC的自然发展进程可分为分子阶段、临床前阶段和临床/症状阶段。分子阶段是肿瘤的生物发生过程，通常指的是以慢性肝炎和肝硬化为特征的肿瘤发生前阶段，此阶段实现了肝细胞、胆道上皮细胞或干细胞的转化。肝细胞、胆道上皮细胞等分化细胞的遗传学改变导致了高度增生型细胞的产生，这类细胞有抗凋亡的作用，而干细胞的遗传学转变则会引导细胞走向一条异常的分化之路。在临床前阶段，患者通常无症状，此时影像学检查能否发现肿瘤并无定数。临床阶段则与症状息息相关，这一时期通常发生在肿瘤生长至4～8 cm时。
　　研究HCC个体的发生发展或可为其早期发展阶段的治疗干预提供洞见。为了进一步明确其发生发展状况，目前该领域正在尝试通过系统生物学方法，将癌症基因组学、表观遗传学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学的高通量数据整合到计算框架中，从而构建出高分辨率的HCC发展图谱[8]。
　　尽管目前对HCC分子多样性的研究已经有相当大的进展，但不可否认的是这还只是个开始[9]。这类研究的进一步推进不仅是提高HCC的诊断和管理策略的保障，也是施行有效监测计划的基础。现有的研究显示，癌变与异常的基因组和转录环境有关，其环境超出了蛋白质编码基因的范畴，延伸到几类结构和功能不同的非编码RNA上[10]。转录中最初的表观遗传变化通常是由生长因子和促炎性细胞因子的增加引起的。此后，染色体重排导致的原癌基因扩增和抑癌基因缺失进一步引发癌变。若HBV整合到基因组中，或能通过插入突变的方式促进肝癌发生，且HBV和HCV都有直接调节宿主的信号通路促进肝细胞转化的潜能。
　　3 HCC的常规诊断
　　目前HCC的常规检测方法主要包括影像学检查、组织活检和血液学检查，其中影像学检查起鉴定性作用。但是影像学检查存在许多无法忽视的弊端，例如：常规的超声检查其准确性和灵敏度非常有限。CT和MRI技术受其自身复杂性和高成本等因素的影响，在HCC的监测方面实用性都不高。而活检无疑会给患者带来不小的痛苦，且其检出率会受到多重因素的干扰，同时还存在相当大的安全隐患。血液学检查毫无疑问是最适合推广的检测方法，但是就目前来看，AFP和其他的一些血清生物标志物在HCC的诊断中只能起次要作用。由此可见，开发新的血清生物标志物用于HCC的诊断迫在眉睫。
　　4循环miRNA与肝癌的关系
　　4.1循环miRNA  新型血清生物标志物的发现有望实现肝细胞癌的早期诊断及预后改善。目前大量学者通过研究发现了一种极具研究前景的新型分子生物标志物——miRNA。miRNA是短的（22nt）单链非编码RNA，其以序列特异性方式结合信使RNA（mRNA）来调节基因表达。它在基本的生物过程（如分化，增殖，凋亡和维持机体内稳态）中发挥着重要作用。迄今为止，已经有超过500种miRNA在人类中完成了鉴定工作。研究发现，首先在细胞核中，在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的介导下转录miRNA相关基因到初级miRNA（pri-miRNA），此时的pri-miRNA长达几千nt，随后在微处理复合物Drosha-DGCR8的作用下，将转录得到的pri-miRNA切割成单个或多个前体miRNA（pre-miRNA），此时的pre-miRNA是一种发卡结构，到此时细胞核内进行的过程结束。接着在Exportin-5-Ran-GTP复合物的作用下将pre-miRNA从细胞核内转运至细胞质中，被另一种RNaseⅢ内切核糖核酸酶Dicer进一步加工，将pre-miRNA剪切为成熟的长度，这时miRNA仍处于双链状态，紧接着双链的miRNA被转载进AGO2蛋白，形成RISC（RNA诱导沉默复合体），在RISC复合物中miRNA双链中的一条链保存下来，称之为“guide”链，另一条链“passenger”则排出复合物外并迅速降解，成熟的miRNA可介导下游靶标mRNA 的转录抑制以及脱腺苷化（图1）。主要miRNA的交替加工本被称为同分异构体，可以导致成熟的miRNA有别于其基因组序列。这种同分异构体是多次加工的产物，其中包括通过增添核苷酸（通常是腺嘌呤或尿嘧啶）修饰3'末端、核苷酸的内部编辑以及由Drosha和Dicer精确切割位点的变异性导致的5'末端缺失/添加。同分异构体在不同的发育过程和疾病状态下相对分布有所改变。例如，在果蝇发育早期，miRNA的3'末端有丰富的非模板添加腺苷;某些异构体在良性胃组织中比较有优势，而有些异构体则在胃肿瘤中更占优势。经过一系列加工得到的成熟miRNA（包括组织特异性miRNA）进入血液循环后，可通过灵敏的RT-PCR扩增技术进行检测（图2）。 　　miRNA具有的組织特异性表达模式，增添了它作为候选生物标志物的独特魅力。在传染病领域，病毒特异性miRNA或某类微生物共有的miRNA可以在血液中进行检测。在癌症领域，miRNA表达出现失控，一些通常在胚胎期表达的miRNA被重新激活，与此同时那些具有肿瘤抑制活性的miRNA下调。由此可见，miRNA的表达可作为肿瘤来源的指纹图谱和疾病侵袭性的标志。
　　4.2循环miRNA与HCC的联系  miR-483-5p可能是与癌症患者生存时间缩短相关的生物标志物[11]。其早期也被认为是HCC的血清标志物。胰岛素样生长因子2（IGF2）是肝细胞癌体内实验模型的表达驱动因子。miR-483-5p是从IGF2位点表达的内含子miRNA，介导细胞核功能，主要靶向胎儿IGF2 P3转录本的5'-UTR，增加胎儿IGF2信使RNA水平。有研究发现，IGF2在肝细胞癌患者中显著过表达[12]。具体来说，乙肝病毒X（HBx）蛋白低甲基化IGF2胎儿启动子，使IGF2 P3 mRNA在HBV感染的肝细胞癌患者中表达[13]。miR-483-5p的表达并不仅仅依赖于IGF2，它与IGF2 P3 mRNA的5'-UTR结合，触发IGF2的表达，形成正反馈回路[14]。且miR-483-5p在IGF2依赖性肉瘤细胞中的异位表达与体内肿瘤发生增加相关。就miR-483-5p的作用机制而言，它可以整合到线粒体分裂机制中，通过靶向FIS1影响线粒体凋亡通路[15]，或通过靶向RhoGDI1和ALCAM促进上皮间充质转化，影响肺腺癌的侵袭转移[16]。它也通过结合SRF（血清反应因子）的3'-UTR影响血管生成[17]。近年学术界在MiR-483-5p的作用机制研究方面成果颇丰。比如，miR-483-5p通过抑制多发性对称性脂肪瘤中的RhoA/ROCK1/ERK1/2途径促进脂肪形成[18];miR-483-5p通过靶向RBM5促进前列腺癌细胞增殖和侵袭[19];有报道称，KLF4-miR-483-CTGF通路的测定和评价对于监测川崎病的发展和治疗具有重要意义[20]。有学者通过血清miRNA筛选和功能研究发现，miR-483-5p是系统性硬化症纤维化的潜在驱动因素[21]。除此之外，目前还有很多种miRNA被认为可以直接靶定其下游靶点或者间接通过被其上游调节器靶定，从而对肝细胞癌起到促进或者抑制的作用，见表1。
　　5总结
　　利用血清循环miRNA作为早期检测肝细胞癌的新型生物标志物可以简化临床检测手段，降低检测风险（组织活检时可能产生的癌细胞转移），减轻患者的痛苦和抵触情绪，真正做到全面筛查肝细胞癌的高危人群，提高检测的准确性。
　　综上所述，miRNA作为肝细胞癌的早期检测标志物有着良好的应用前景。
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　　收稿日期：2019-3-9;修回日期：2019-3-19
　　編辑/杨倩
　　作者简介：赵瑶瑶（1994.6-），女，湖北孝感人，硕士，主要研究领域为分子生物学
　　通讯作者：胡佳杰（1967.12-），男，湖北天门人，博士，副教授，研究方向为分子病毒学
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