肝纤维化诊疗研究进展

来源:用户上传      作者:李以军

　　【摘要】肝纤维化是由一系列慢性肝脏疾病相互作用共同形成的病理状态，是轻度肝损或炎症刺激而发展为肝硬化的早期必经阶段的病症。通过整理近五年国内外对肝纤维化、抗肝纤维化的研究，分析肝纤维化的发生机制、抑制机制，总结中药有效成分生物碱抗肝纤维化的作用及相关作用机理，为扩展肝纤维化研究思路提供参考，为后续以中药活性成分生物碱研发抗肝纤维药物奠定理论基础。
　　【关键词】肝纤维化;作用机制;生物碱;研究进展
　　【中图分类号】R575.2【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）9-0048-06
　　肝纤维化是由于炎症、病毒或组织代谢障碍等诱因作用于肝脏，引起肝细胞损伤或坏死，而引发肝炎，炎症持续状态下，诱发肝脏细胞（如HSC、KC、SEC等）异常活化，通过其自分泌或旁分泌释放多种细胞因子（如TGF-β、PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6等）[1]，合成分泌大量细胞外基质（ECM）（如Ⅰ型、Ⅲ型胶原、HA、LN等）[2]，下调MMPs-mRNA及上调TIMPs-mRNA和α-SMA表达等[3-5]。上述众多异常生理过程的共同作用，大量的ECM滞留并沉积在肝脏，导致肝纤维化。肝纤维化的发生机制是由多条途径相互作用呈现，则抗肝纤维化作用机理也应对应多个靶点。目前认为非实质肝细胞HSC的活化和增殖是导致肝纤维化的关键过程[6]。若能及时抑制诱因，阻滞HSC活化，并去除过量的ECM，肝纤维化得以减轻缓解，亦可逆转恢复正常的肝功能状态[7-8]。若不重视肝纤维化病程，其将发展为不可逆转的肝硬化或肝癌。因此，关注肝纤维化并了解其发生机制后，选择合适的抗肝纤维化途径，有效地防止肝硬化或肝癌的发生，降低癌症致死率。
　　1肝纤维化的诊断方法进展
　　1.1检测肝功能指标和血清肝纤维化指标目前，通过检测肝功能指标初步判断肝纤维化及其程度。常用的肝功能指标有血小板计数、AIT、AST、HA、Col-Ⅰ、CoI-Ⅲ等。检测结果与正常肝功能指标范围对比，即可知道当前的肝功能状况。此诊断方法需要结合多个指标结果[9]，方可初步判断肝功能状况，结果存在假阳性，不能确切诊断肝损程度或肝纤维化。
　　1.2肝活检方法肝活检通过创伤性肝穿刺抽取肝组织，观察其形态的改变，结合临床资料，可作出肝病的诊断[10]。因所取肝组织标本较小，则难以准确地反映出病变的性质和程度，不能代表肝脏的全部病变。
　　1.3基于基因水平的诊断肝纤维化的诊断发展到基因水平阶段，国内外公认检测HA含量最能反映肝功能状态。研究实验进行多个指标比较，发现血清中存在的PDGF-BB 含量[11]能更准确地反映肝纤维化程度。亦有实验结果表明检测外周单个核细胞中TIMP-1 mRNA水平较血清蛋白水平准确，原因是TIMP-1能与MMP-1受体结合，准确地反映出MMP-1水平及肝纤维化程度[12-13]。
　　1.4其他诊断方法姚瑶等[14]采用电化学阻抗的蛋白传感器检测血清肝纤维化标准物OPBs，诊断肝纤维化。王帅等[15]利用声辐射力脉冲成像技术，无创诊断肝纤维化程度、肝纤维化干预及动态观察疗效，提高诊断率。苏李娜等[16]使用CT扫描计算肝细胞外体积分数无创性评估肝纤维化。
　　1.5综合诊断以简单且无创伤性的方法诊断肝纤维化，结果准确性不高且缺乏科学完整性。因此，应综合诊断肝纤维化，先了解患者有关病史及肝功能异常情况，应用多种诊断方法[17]检测肝纤维化指标，结合临床资料综合分析，方可准确判定肝纤维化程度[18]。
　　2肝纤维化的发生机制
　　目前，国际上对肝纤维化发生机制的探索主要集中在肝星状细胞（HSC）激活作用机制的研究。结果表明，肝纤维化的形成是由于炎症，病毒或组织代谢障碍等[19-20]诱因作用于肝脏，引起肝细胞损伤或坏死，而引发肝炎，炎症持续状态下，诱发肝脏细胞（如HSC、KC、SEC等）异常活化，通过其自分泌或旁分泌释放多种细胞因子（如TGF-β、PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6等），活化的HSC不断转变为肌成纤维细胞，合成分泌大量细胞外基质（ECM）（如Ⅰ型、Ⅲ型胶原、HA、LN等），下调MMPs-mRNA及上调TIMPs-mRNA和α-SMA表达等，导致ECM大量滞留并沉积在肝脏组织中，使肝细胞基底膜变形扭曲动态重建，支架不断纤维化，持续蔓延发展至整个肝脏纤维化。
　　2.1HSC的活化及作用机制HSC是来自Disse间隙的非实质性细胞，占肝脏细胞总数的5%～15%，合成分泌ECM。在正常生理情况下，HSC分泌的ECM参与构建肝脏细胞基底膜和作为基质维持肝脏细胞生命活动，处于动态平衡状态。而肝脏处于病理状态时，HSC被激活，生理功能出现异常而合成分泌大量细胞因子（如TGF-β、PDGF、TNF-α等），这些细胞因子通过分子信号传导通路启动HSC-DNA进行有丝分裂增殖活化HSC，使诱导HSC转化为肌成纤维细胞或分泌大量的ECM（如Ⅰ型、Ⅲ型胶原、HA、LN等），促进TIMPs-mRNA和α-SMA表达，而抑制ECM降解，其中HA和LN能使Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原聚集沉积，肝脏基底支架不断纤维化，最终发展为肝纤维化[21-23]。由此可见，HSC活化的途径是研究肝纤维化发生机制的热点问题。
　　2.2细胞因子激活及机制体外模拟HSC激活状态的实验，发现在HSC活化增殖的对数期间，某些细胞因子如TGF-β、TNF-α、PDGF、PAF、IGF-1、IL-1、ET-1、AngⅡ等活性水平異常升高，表明细胞分子与HSC活化有密切关系[24-25]，已得知肝纤维化的发生与发展是多个细胞因子的共同作用的结果。
　　2.2.1转化生长因子β（TGF-β）正常生理情况下，TGF-β主要由Ito细胞合成分泌，具有调节肝脏细胞生长和分化功能的细胞因子[26]。很多研究表明活化的肝脏细胞产生TGF-β水平明显高于静置细胞，几乎所有的肿瘤细胞均含有TGF-βmRNA，胶质细胞含量更高，国际上也已公认TGF-β是最强的促肝纤维化因子[27]。在肝损或炎症信号的诱导下，Ito细胞异常活跃，合成分泌出大量的TGF-β，而TGF-β主动与HSC胞膜上的相应受体结合成TβR。随着TβR不断增殖活化，引起Smad家族蛋白中的R-Smad蛋白被磷酸化，使其与Co-Smad蛋白形成共同通路蛋白异源Smads多聚体，随后其转位进入HSC胞核内与HSC-DNA上特定的受体结合而启动HSC的分化增殖，进而活化HSC。大量的信号分子TGF-β分泌，并通过TGF-β-Smad信号通路传导，持续引起HSC活化增殖，异常大量分泌ECM，且上调TIMP-1mRNA和α-SMA表达[28]和下调MMP-1mRNA表达，抑制ECM降解，大量ECM滞留并沉积于肝内窦基底，而引发肝纤维化。 　　2.2.2肿瘤坏死因子α（TNF-α）在肝损或炎症刺激等病理情况下，肝窦内的巨噬细胞肝枯否氏细胞（KC）异常活化，产生大量的TNF-α。正常生理情况在，TNF-α能抑制或杀伤肿瘤细胞。因TNF-α为炎症因子，介导NF-？B信号传导通路[29]，诱发或加重炎症，并参与自身免疫病的病理损伤。有研究表明[30]TNF-α可刺激Ito合成释放TGF-β，活化HSC，促进蛋白多糖HA、LN合成，使其参与肝脏细胞基底膜网状纤维化;亦可影响TGF-β1对I型前胶原mRNA的表达而抑制纤维母细胞胶原的合成。
　　2.2.3血小板衍生生长因子（PDGF）和血小板活化因子（PAF）PDGF是一种具有较强有丝分裂活性的二聚体蛋白，而PAF属于活化血小板的磷酯类。在慢性肝炎病程中，PAF活化血小板且血小板、KC及HSC又受到持续的刺激，不断分泌大量的PDGF，使其受体上调[31]，引起HSC异常活化增殖，促进HSC合成分泌多種细胞因子TGF-β、TNF-α等，异常表达α-SMA蛋白的收缩功能，影响HC对外源性胶质和VitA的摄取，导致活化的HSC转化为肌成纤维细胞，而抑制肝窦血流和改变肝小叶结构，造成肝纤维化病态。
　　2.2.4胰岛素样生长因子（IGF）IGF是一类由肝脏细胞自分泌并具有胰岛素样代谢效应的活性蛋白多肽物质，调控着多功能细胞的分裂增殖，抑制了相关细胞的凋亡。其中，胰岛素样生长因子结合蛋白5（IGFBP5）通过IGF-1依赖机制抑制活化态HSC凋亡，增加HSC转化为肌成纤维细胞[32-33]。随着HSC增殖活化，通过自分泌或影响旁分泌释放大量IGF，反作用于HSC，形成恶性循环，并出现HSC活化异常样症状，加速肝纤维化形成[34]或导致非酒精性脂肪肝炎[35]。
　　2.2.5白细胞介素（IL）IL可由KC合成分泌，具有非特异性调节细胞增殖分化和免疫调节能力。若IL大量存在，诱发肝脏急性期，趋化炎症细胞分泌大量PDGF、TGF-β、TNF-α等细胞因子，加重炎症反应，激活HSC，逐渐发展为肝纤维化。IL分有IL-1家族、IL-6家族和IL-10家族等，其中IL-1可直接活化HSC，并促进其向肌成纤维样细胞转化，李京等[36]通过实验证明IL-1β与肝纤维化的形成有关;而IL-6通过上调TIMPs-mRNA和α-SMA表达和下调MMPs-mRNA表达，使ECM滞留并沉积，而导致肝纤维化的出现。而Transwell实验[37]表明IL-10是肝纤维化的抑制因子。
　　2.2.6内皮素-1（ET-1）ET-1广泛存在于血管内皮和细胞，具有维持基础血管张力和血管系统稳态的生物学功能[38]。已活化的HSC高水平表达其受体而合成分泌ET-1，亦可促进窦内皮细胞异常分泌ET-1。而ET-1大量存在会反作用于HSC和收缩胶原纤维束，抑制肝窦血流而导致血瘀，基底膜形状扭曲，而改变肝小叶形态结构，ECM聚集沉积形成假小叶，导致肝纤维化[39]。
　　2.2.7血管紧张素Ⅱ （AngⅡ） AngⅡ是一种生物活性肽，调节着肾素-血管紧张素系统的生物学功能。有关实验[40-41]证明AngⅡ能上调Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因表达，促进肝纤维化，其发生机制慢性肝炎反应，刺激AngⅡ异常分泌而诱导COX-2催化PGs合成，参与炎症反应，炎症持续不消，亦会刺激肝脏细胞活化，进而促进肝纤维化。亦有庞雪芬等[42]以实验证明AngⅡ通过影响TGF-β-Smad信号传导通路，激活HSC分泌大量胶原蛋白，导致肝纤维化。
　　2.3细胞外基质异常增多机制及后果ECM主要由HSC合成分泌的生物大分子（如Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原、HA、LN等），为肝脏细胞的生长、增殖及分化提供物质基础，亦可起支架的作用维持肝脏组织的形态。正常情况下，ECM的分泌量与起生理作用量存在动态平衡。而在肝损或炎症等病理状态下，HSC受到异常激活，通过自分泌或旁分泌大量的ECM[43]及多种细胞因子，上调TIMPs-mRNA[44]和α-SMA表达和下调MMPs-mRNA表达，而抑制胶原的降解，大量蛋白多糖HA和糖蛋白LN聚集胶原[45]并沉积于肝脏，导致肝脏细胞基底膜变形破坏，膜支架不断纤维化，而加速肝纤维化[46]。
　　2.3.1胶原胶原为ECM的主要成分，分为纤维性胶原和基层模性胶原，其中纤维性胶原主要有Ⅰ型、Ⅲ型胶原，二者为肝脏基底核心轴维持组织器官的形态结构，肝纤维化早期能明显检测到Ⅲ型胶原，而晚期主要为Ⅰ型胶原;基层模性胶原主要有Ⅳ型胶原，其主要位于肝血窦内皮，参与肝脏细胞基底膜形成，对Ⅰ型、Ⅲ型胶原形成的骨架有链接作用。若胶原分泌过多，基底膜骨架易被纤维化，引发肝纤维化。若能及时降解过量的胶原，可防止或逆转肝纤维化[47]。
　　2.3.2蛋白多糖（PG）PG是一类能连接蛋白骨架的多糖分子，如HA、硫酸软骨素等[48]。HSC活化状态下，合成分泌出大量HA，并加剧前胶蛋白合成，而HA可促进胶原蛋白分子的聚集，使肝脏基底骨架不断纤维化，而促进肝纤维化。
　　2.3.3糖蛋白糖蛋白是ECM的组成成分，主要有纤维连接素FN和层连蛋白LN。其中，LN主要由HSC和KC合成分泌，存在肝脏基底膜。已有实验[49]证明在肝脏基底膜上，LN与Ⅳ型胶原存在特异性结合位点，二者共同参与肝窦毛细血管纤维化的形成。
　　2.3.4其他细胞外基质炎质体是一种多蛋白复合体，通过上调TGF-βmRNA和Ⅰ型胶原基因表达，而激活HSC，促进肝纤维化[50]。酸性神经磷酸酯（ASMase）通过ASMase-CtsB信号传导通路，使HSC增殖活化，进而形成肝纤维化。
　　3抗肝纤维化的作用机制
　　目前，国内外对抗肝纤维化的作用机制研究[51-53]大多集中在抑制HSC活化，诱导其凋亡，或减少TGF-β分泌等方面，较少针对防止肝损或炎症侵染等外来诱因，或增强MMPs活性，抑制TIMPs-mRNA和α-SMA表达，进行标本同治肝纤维化。 　　3.1HSC的抑制及作用機制炎症、病毒或组织代谢障碍等病理诱因均能导致肝实质细胞损伤，而非实质细胞HSC、KC等活化。HC受损，减弱摄取外源性基质和VitA的能力。HSC、KC等活化，刺激自分泌或旁分泌大量的细胞因子，而不断激活HSC，同时分泌大量的ECM，促进活化的HSC转化为肌成纤维样细胞。因此，阻止炎症和病毒感染肝脏，有效防止肝损是避免HSC被持续激活的关键措施，同时诱导活化HSC恢复静息状态或程序性凋亡。临床上，可选用抗炎药、抗菌或抗病毒药联用保肝药，针对性地去除诱发HSC活化的病原体，防止HSC活化，保护未被损伤肝脏组织，增强肝细胞免疫能力，减轻或逆转肝纤维化[54-55]。
　　3.2相关细胞因子抑制及作用机制抗肝纤维化的细胞因子主要有干扰素类（IFNs）。其中IFN-α相关凋亡诱导配体（TRAIL），通过上调细胞线粒体Bax和胞浆半胱氨酸蛋白酶caspase-3表达，进而诱导HSC凋亡。王媛媛等[56]通过调节Bcl-2/Bax信号途径而发挥抗肝纤维化作用。IFN-β能够下调α-SMAmRNA和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达，而抑制α-SMA收缩作用，防止胶原增殖过多导致肝纤维化的发生。研究发现IFN-β能抑制TGF-β-Smad信号传导通路中Smad4蛋白的表达及促进Smad7基因的表达，而阻滞HSC活化增殖，并抑制HSC转化为肌成纤维细胞，使肝纤维化病症得以缓解。骨形态发生蛋白-7（BMP-7）抗肝纤维化作用机制与IFN-β相似。IFN-γ通过JAK-STAT信号传导通路抑制STAT介导腺苷环化酶妨碍A2A受体功能，从而阻断Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达，减少胶原的合成，防止进一步肝纤维化。李红等[57]通过JAK-STAT信号传导通路抑制JAK2和STAT3的表达水平，从而影响HSC活化增殖，减少胶原纤维分泌，而减轻肝纤维化病态[58]。其他抑制因子，如重组人decorin蛋白（rhdecorin）可抑制TGF-β1对HSC的激活作用，下调MMP-2mRNA和TIMP-1mRNA表达，恢复MMPs降解ECM作用，得以减轻或逆转肝纤维化[59]。黄运德等[60]通过抑制TGF-β1及TGFβR1的表达或是阻断TGF-β所在信号传导通路传导信息，而抗肝纤维化。核转录因子（NF-κB）被TNF-α等细胞因子激活，通过NF-κB信号传导通路进入HSC核内，与HSC-DNA特定受体结合，启动HSC程序性凋亡，进而防止肝纤维化进展[61]。
　　3.3ECM的降解及作用机制降解过多而沉积于肝脏组织中的ECM是减轻或逆转肝纤维化的重要措施。肝脏组织中存在降解ECM的基质金属蛋白酶（MMPs），其中MMP-1主要降解Ⅰ型胶原。而MMP-2降解功能强大，能降解各类型胶原及支架蛋白，易破坏Disse间隙基底膜，活化HSC，促进肝纤维化发展。而抑制TIMP-1和α-SMA的活性[1]亦可增强MMPs作用[62]。因此，通过上调MMP-2mRNA表达及下调TIMPs-mRNA和α-SMA表达，加速沉积的ECM降解，减轻或逆转肝纤维化。
　　4中药成分生物碱抗肝纤维化的作用及作用机制
　　中医认为肝纤维化基本病机主要为湿热疫毒滞留，导致血瘀阻络，气阴两虚。因此治疗肝纤维化应以肝脾肾三脏为主，以扶正补虚，活血化瘀[63]为治疗根本，基本治疗益气养阴、疏肝健脾、清热利湿等。生物碱有抗肿瘤、解热镇痛、抗菌、抗疟疾和抗过敏等药用价值[64]。某些中药（如苦参、秋水仙，喜树、黄连等）药用功效有清热燥湿、活血化瘀、消炎止痛、杀虫，抗癌等，活性成分多含有生物碱类物质。近年来，不断有以中药成分生物碱抗肝纤维化的实验研究，发现有些生物碱可抑制HSC增殖并诱导凋亡，证明有些生物碱（如苦参碱[65]、小檗碱[66]、秋水仙碱[67]等）可用于肝纤维化的治疗，亦具有抗炎、抗病毒、抗脂质过氧化和保肝作用。其抗肝纤维化的作用机制为直接抑制炎症扩增，杀灭病毒，减轻炎症对肝细胞的损伤致死，促进肝细胞再生[35]，亦可直接抑制HSC、FSC、KC等细胞活化增殖，进而减少TGF-β、TNF-α、PDGF、IGF-1、IL-1等细胞因子的分泌，从而阻断TGF-β-Smad信号传导通路，间接地抑制HSC活化增殖，诱导HSC凋亡，减少肌成纤维细胞增殖，下调Ⅰ型胶原基因及TIMPs-mRNA的表达[34]，增强MMP-1降解ECM活性[33]，减轻或逆转肝纤维化，改善肝功能。
　　5小结
　　肝纤维化的发生机制非常复杂，是由肝脏细胞，多种细胞因子和细胞外基质，并涉及多条信号通路共同参与的病理过程。中药活性成分生物碱能有效地针对多种机制引起的肝纤维化，不良反应少毒性小[68]，因此其有望成为广谱抗肝纤维化用药，后续的研究亦可以生物碱能抗肝纤维化拓展开发新的药用植物。
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