循环肿瘤细胞在肺癌诊疗中的临床研究进展

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　　摘要：肺癌现已成为发病率及致死率最高的恶性肿瘤，且呈逐年增高趋势，给人类的身体健康及生命安全带来严重威胁。肺癌的复发与转移是导致患者死亡的最主要原因，可能与循环肿瘤细胞（CTCs）进入血液存在一定关系，CTCs在肺癌患者的早期诊断、治疗指导、疗效评估及预后等方面具有十分重要的作用。本文就CTCs在肺癌诊疗中临床应用及研究进展进行综述。
　　关键词：肺癌;循环肿瘤细胞;反转录聚合酶链反应
　　中图分类号：R734.2                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.15.019
　　文章编号：1006-1959（2019）15-0058-03
　　Abstract：Lung cancer has become the malignant tumor with the highest incidence and mortality， and it is increasing year by year， posing a serious threat to human health and life safety. The recurrence and metastasis of lung cancer is the most important cause of death， which may be related to the entry of circulating tumor cells （CTCs） into the blood. CTCs play an important role in the early diagnosis， treatment guidance， efficacy evaluation and prognosis of lung cancer patients. . This article reviews the clinical application and research progress of CTCs in the diagnosis and treatment of lung cancer.
　　Key words：Lung cancer;Circulating tumor cells;Reverse transcriptase polymerase chain reaction
　　肺癌（lung cancer）属于一种起源于肺泡上皮、细支气管上皮、支气管腺体及支气管上皮的恶性肿瘤，现已成为发病率及致死率最高的恶性肿瘤，且呈逐年增高趋势，给人类的身体健康及生命安全带来严重威胁。肺癌的复发与转移是导致患者死亡的最主要原因，大部分肺癌患者会出现肾上腺、肝等远处器官转移，在其转移过程中血液循环系统发挥着重要的作用[1]。相关研究显示，肿瘤细胞的复发与远处转移可能与循环肿瘤细胞（circulation tumor cells，CTCs）进入血液存在一定关系[2]。为此，本文就CTCs在肺癌诊疗的临床应用及研究进展进行简单阐述。
　　1肺癌循环肿瘤细胞概述
　　CTCs是Ashworth于1869年在1例肿瘤死亡患者血液中所发现的，其形态与体积与原发肿瘤细胞相似[3]。当前临床主要将CTCs定义为因诊疗操作或自发导致的由转移灶或实体瘤释放而进入外周血液循环的肿瘤细胞。Pixberg CF等[4]的研究发现，启动子中的三个基因的甲基化会导致肿瘤细胞上皮-间质转化（EMT）的发生，而这种转化会导致肿瘤细胞出现散播与转移。Yadavalli S等[5]的研究结果显示，在CTCs发生远处转移的过程中，白细胞外渗通路途径发挥了十分重要的作用。此外，其还发现多数癌症CTCs存在不同数量的间质及上皮细胞标记物表达[6]，说明EMT具有多样性与动态性特点，上述观点对癌症进展与转移的临床研究具有重要意义。
　　2肺癌循环肿瘤细胞检测
　　CTCs在外周血液中存在较少，一般每106～107单核细胞中存在一个CTC，因此，CTCs的检测对检测方法的敏感度及特异性要求较高[7]，当前较为常用的肺癌CTCs的检测方法主要有以下几种。
　　CTC芯片技术是一种可以对血液中CTCs进行有效分离的微流体检测技术，芯片由结合EpCAM抗体的微阵列组成，在对血液样本采用特定流速与芯片进行接触后，可使EpCAM的阳性细胞依附于微阵列，从而通过对芯片信号的检测来对外周CTCs进行检测[8]。现阶段CTC芯片技术主要应用于前列腺癌[9]、肝癌[10]、胃癌[11]等患者的外周CTCs檢测。
　　反转录聚合酶链反应（RT-PCR）及以其为基础的改进检测技术在临床CTCs检测中应用较为广泛，RT-PCR检测技术主要是基于PCR采用特异性引物对肿瘤特异性mRNA序列反转录的DNA片段进行扩增，进而对肿瘤或病灶组织特异性mRNA的表达进行识别。RT-PCR技术操作简单，且具有高特异性、高敏感性级高效率等优点，但游离的特异性mRNA半衰期较短，在血液样本收集或细胞凋亡后，其在外周血液中会被RNA酶迅速降解致使其在正常外周血中不表达，导致假阳性检测结果的发生[12]。当前较为先进的实时定量RT-PCR、巢式PCR及荧光定量PCR等技术虽然在一定程度上提升了检测的特异性与敏感度，但对CTCs仍然难以做到精确计数。 　　细胞搜索系统属于一种基于染色与磁免疫的免疫细胞化学方法，其主要应用EpCAM抗体磁珠对CTCs进行富集，利用强磁场作用将其由血液中提取出来，将分离的肿瘤细胞进行固定、通透并采用荧光抗体染色的角蛋白进行鉴定、分析[13]。该种检测方法被FDA于2004年批准用于临床转移性前列腺癌、大肠癌及乳腺癌患者的CTCs檢测与分析，且在肺癌CTCs的临床研究中应用较为广泛[14]。
　　3肺癌循环肿瘤细胞与转移
　　导致肺癌患者死亡的最主要原因是肿瘤细胞发生远处转移形成转移瘤，相关研究发现[15]，晚期肺癌患者CTCs阳性检出率远高于早期患者，且Ⅰ期肺癌患者常规检测无临床转移病灶，但仍可检测出CTCs，说明在现有临床分期的早期肺癌患者已经发生隐匿转移。隐匿转移又称为微转移，其是指采用常规病理及如PET、MR、CT等常规影像学手段无法检测到的隐匿在原发肿瘤病灶以外的组织中的转移病灶，其经过合适的环境及一定的时间会逐渐进展为临床可见病灶。相关研究显示[16]，由原发肿瘤部位转移扩散或许是癌症进展的早期事件，并非之前所认为的癌症后期结果。作为定植于远处器官的肿瘤细胞，CTCs虽然会经常保持休眠，但其最终仍会发展为可见的转移性病灶。肿瘤细胞进入血液循环系统是出现远处转移的关键步骤，肿瘤细胞在肺癌实体瘤上的不断增殖，由EMT转变为具有侵袭、转移能力的外周血CTCs，之后CTCs溢出脉管系统并在此通过EMT在远隔器官上定植，形成转移病灶[17]。相关研究表明[18]，EMT能够对细胞间的结合力进行削弱，改变细胞骨架并提高降解基质的能力，使肿瘤细胞的迁徙与侵袭得到促进，抗凋亡信号得到增强，最终在血液中存活。由此可以看出，CTCs通过EMT转化出现了本质上的改变，并且获取了更强的肿瘤干细胞样表型与侵袭能力。由此可推测，部分具有强大致瘤性、多能性及自我更新性的干细胞样CTCs在肿瘤转移过程中发挥着关键作用。为此，通过深入研究获取EMT的CTCs，不但能优化具有EMT相关标志物的CTCs的检测方法，同时还可以促进针对高侵袭性细胞的靶向治疗方法的研究。
　　4肺癌循环肿瘤细胞临床应用
　　当前对于肺癌的诊断主要依靠肿瘤标志物、病理学及影像学，然而因其早期并无明显症状导致大多数患者在就诊时病情已达中晚期，无法取得较好的治疗效果，对预后造成严重影响[19]。由此可以看出肺癌的早期诊断与分期对患者的治疗效果及预后具有十分重要的作用。多位学者就CTCs对肺癌的诊断价值进行了大量研究，Xu Y等[20]选取66例非小细胞肺癌患者作为实验组，20例健康体检者作为对照组，采用细胞搜索系统对两组患者外后血CTCs进行检测，结果显示实验组中检测到CTCs者达到47例，对照组未检测到。结果提示，CTCs检测用于肺癌的诊断具有较高的特异性与敏感性。此外，在其对实验数据统计分析过程中发现，CTCs阳性率与肿瘤的病理学分期存在一定关系，ⅢA期肺癌患者CTCs阳性率最低，ⅢB期患者CTCs阳性率低于Ⅳ期患者。由此可以看出CTCs对于肺癌的诊断与分期具有一定的特异性与敏感性。肺癌患者的治疗方法主要包括放射治疗、分子靶向治疗、化疗等，不同的治疗方法对于不同时期及不同类型的肺癌患者治疗效果存在一定差异。钟光华等[21]学者在肺癌患者研究中发现，吉西他滨能够通过HGF/cMet通路靶向对抗EpCAM阳性的CTCs从而抑制非小细胞肺癌的微转移。在此次研究中选取了40例在化疗前后均为CTCs EpCAM阳性患者作为研究对象，并将其分为CD45阴性与EpCAM阳性两组，比较采用不同药物进行治疗时CTCs中HGF/cMet通路的被抑制情况，结果显示，加用吉西他滨进行治疗的患者其肿瘤细胞的EMT过程与HGF/cMet通路均受到抑制，降低了肿瘤细胞的侵袭与迁徙，且在之后3年的随访过程中发现，应用吉西他滨治疗的患者生存率更高。另外，加强对肺癌患者外周血CTCs数量增减的监测能够有效反映患者病情的改变，对治疗方案的疗效评价具有一定的指导意义。范军振等[22]学者研究发现，进展期非小细胞肺癌患者治疗后CTCs数目较治疗前显著减少，且病情稳定恢复，整体治疗效果良好。结果表明对肺癌患者外周血CTCs数量的增减进行监测能够有效反映患者治疗过程中的病情改变情况。
　　此外，对于是否能采用CTCs作为判断肺癌患者的预后因素，不少学者也做了大量研究。张晓茜等[23]在循环肿瘤细胞与肺癌患者预后相关性的Meta分析中发现，与原发性肺癌CTCs阳性患者预后效果比较，肺癌CTCs阴性患者预后效果明显更佳，可见，对肺癌患者进行外周血CTCs检测有助于指导原发性肺癌患者临床治疗及预后判断。叶春晖等[24]在晚期非小细胞肺癌102例患者治疗中分组分别应用培美曲塞联合顺铂、吉西他滨联合顺铂、多西他赛联合顺铂进行治疗，治疗后对患者外周血CTCs EGFR基因表达情况进行检测发现三组患者外周血CTCs EGFR基因突变率较治疗前显著增加，但组间并无统计学意义，虽无法明确化疗是否可以改变肺癌患者外周血CTCs EGFR基因突变状态，但是可以根据患者外周血CTCs EGFR基因表达情况指导制定靶向治疗方案。李发凯等[25]在对23例非小细胞癌化疗前后进行外周血CTCs 检测，化疗后3周、化疗后6周外周血CTCs 计数均较化疗前显著增加，提示在非小细胞癌患者治疗期间检测外周血CTCs 变化，可以作为早期评估治疗效果的一个有效补充指标。以上研究均可一定说明外周血CTCs 变化可以指导临床治疗及预后判断。
　　5挑战与展望
　　临床大量研究已表明，CTCs在肺癌患者的早期诊断、治疗指导、疗效评估及预后等方面具有十分重要的作用[19]。相信随着越来越多的科研人员及临床医生对肺癌CTCs的加大研究，可使得CTCs能够为临床治疗发挥更大的作用。但研究过程中仍面临较多的挑战：①肺癌CTCs作为预后的标准尚未统一，仍需大样本更为具有说服力的研究和更为一致的检测方法以增强其可信性[26];②临床对于肺癌CTCs相关研究尚浅，刚处于起步极端，需积极开展多部门合作的大规模临床研究，以便对CTCs在肺癌研究上的不同意义进行了解;③用于CTCs富集、分离、检测及分析的试剂盒价格太过昂贵，使其难以临床广泛应用，且对于CTCs的计数方法及标准尚不成熟，对CTCs的分子特点与数理无法做到准确检测[27]。
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