外泌体在促进非小细胞肺癌脑转移中的作用

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　　[摘要]目的 探讨外泌体（Exosomes）促进非小细胞肺癌脑转移的作用，为今后的临床诊疗工作提供有价值的参考依据。方法 采用电镜观察和Western blot检测鉴定收集的培养非小细胞肺癌上清中含有的源性Exosomes；利用Exosomes荧光染色与受体NHA细胞共培养，明确Exosomes对受体NHA细胞的作用形式及对NHA细胞活性的影响，并建立体外血脑屏障模型验证外泌体是否参与了非小细胞肺癌穿过血脑屏障转移入脑的过程。结果 分离获得的crExo样品在电镜下呈现为圆形，直径30～1000 nm。Western blot结果显示，crExo样品表达Exosomes标志物蛋白CD63、CD9，對albumin为轻微表达，对内质网蛋白标志物calnexin则不表达。非小细胞肺癌细胞株crExoh浓度检测结果显示，晚期crExo蛋白浓度显著高于早期，差异有统计学意义（P<0.05）。染色观察细胞迁移率，结果显示，Exosomes参与了非小细胞肺癌穿过血脑屏障的过程。结论 Exosomes对肿瘤的增殖、侵袭和转移等生物学行为具有重要的调控作用，非小细胞肺癌发生脑转移也受Exosomes的影响。
　　[关键词]非小细胞肺癌；脑转移；作用；研究
　　[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）5（b）-0056-04
　　Role of Exosomes in promoting brain metastasis of non-small cell lung cancer
　　TANG Xiao-mei YI Xiang-jun ZHANG Li
　　Department of Oncology， Jiangxi Chest Hospital， Nanchang 330006， China
　　[Abstract] Objective To explore the role of Exosomes in promoting brain metastasis of non-small cell lung cancer， so as to provide the valuable reference for future clinical diagnosis and treatment work. Methods The exogenous Exosomes contained in the cultured non-small cell lung cancer supernatant were observed by electron microscopy and identified by Western blot. Exosomes fluorescent staining and co-culture of receptor NHA cells wee used to determine the role form of Exosomes on the receptor NHA cells and the effect on NHA cell activity， and establish an in vitro blood-brain barrier model to verify whether Exosomes are involved in non-small cell lung cancer in the process of transferring the blood-brain barrier into the brain. Results The crExo sample obtained by the separation was circular under the electron microscope and had a diameter of 30 to 1000 nm. Western blot results showed that the excretion marker proteins CD63 and CD9 were expressed in the crExo sample， which was slightly expressed in albumin and not expressed in the endoplasmic reticulum protein marker calnexin. The detection of crExoh concentration in non-small cell lung cancer cell lines showed that the late crExo protein concentration was significantly higher than that in the early stage， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Cell migration was observed by staining， and the results showed that Exosomes was involved in the process of non-small cell lung cancer crossing the blood-brain barrier. Conclusion Exosomes plays an important role in the regulation of tumor growth， invasion and metastasis. The brain metastasis of non-small cell lung cancer is also affected by Exosomes. 　　[Key words] Non-small cell lung cancer； Brain metastasis； Role； Research
　　虽然临床对多发脑转移瘤疾病近年来可以通过手术、全脑或立体定向放射、辅助化疗等多种方式实施综合性治疗，但因血脑屏障的存在，使得很多化疗药物无法进入脑内发挥作用，以致非小细胞肺癌脑转移的预后仍然很差[1-3]。本研究旨在探讨外泌体（Exosomes）促进非小细胞肺癌脑转移的作用。为了证实该设想拟通过鉴定收集的培养非小细胞肺癌的上清中含有源性Exosomes；通过Exosomes与体NHA细胞共培养，明确Exosomes对NHA细胞活性的影响，建立体外血脑屏障模型验证Exosomes是否参与了非小细胞肺癌穿过血脑屏障转移入脑的过程，以期为非小细胞肺癌脑转移的防治提供新的研究方向。
　　1材料与方法
　　1.1细胞培养
　　人非小细胞肺癌细胞株A549，使用含有10%灭活胎牛血清和双抗的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2、85%湿度的恒温箱内培养，0.25%胰酶消化液消化传代。所有实验均采用对数生长期细胞。细胞完全培养液的成分为含有胎牛血清、青链霉素双抗溶液的或培养基。
　　1.2 Exosomes的制备
　　A549细胞经过48 h的培养之后，将细胞上清液留取下来，并将其用于Exosomes的制备过程中。上清液需要通过离心等方式将细胞碎片及杂质除去：在1500 r/min的条件下处理10 min左右，在4℃的环境中、10 000 r/min的条件下处理30 min左右，最后以100 000 r/min的条件下，4℃的环境中，进行离心处理2 h左右，弃上清，将沉淀通过200 μl的PBS实施重悬处理，悬液Exosomes，于-80℃保存。
　　1.3 Exosomes的形态观察
　　采用透射电子显微镜对血清外泌体的具体形态进行观察：在封口膜上放置100目的载样铜网，将20 μl外泌体溶液采用等体积的PBS进行充分稀释，随后滴加到铜网，在室温条件下静止放置1 min左右，并在此环境中将其晾干。接着采用20 μl浓度为3%的磷钨酸钠溶液置于铜网上，进行负染处理1 min左右，随后采用滤纸将多余的液体吸去。将铜网放到透射电镜中之后进行抽真空处理，对外泌体形态进行观察并拍摄相关照片。根据镜下外泌体的实际浓度水平和具体表现出来的背景颜色，对稀释的倍数和染色处理的时间进行适当的调整。以随机的方式对50个Exosomes的直径水平进行测量。
　　1.4 BCA蛋白定量
　　根据BCA试剂盒说明书所叙述的方法进行操作，将经过稀释处理后的0.5 mg/ml crExo蛋白标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20 μl加至96孔板中，每孔体积用PBS补充至20 μl；在3种样本中各加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液，在4℃的环境下进行震荡处理30 min左右；在15 000 r/min的条件下，4℃的环境中，进行30 min左右的离心处理，取上清液作为蛋白样品。取适量同样经过稀释处理的3种Exosomes样品悬液20 μl加入到96孔板当中，每个样品设置复孔数为3个；各孔加入BCA工作液200 μl，37℃放置30 min，放入酶标仪562 nm处测定蛋白浓度。
　　1.5 Western blot检测CD63
　　Exosomes悬液总蛋白的提取使用蛋白抽提液，蛋白浓度水平的测定采用全自动生化分析仪。取同量蛋白上样于浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳处理，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上并置于浓度为5%的脱脂奶粉TBST中，在4℃的环境下进行封闭过夜放置，加封闭液稀释的一抗（1∶200）过夜，用TBST进行洗膜3×15 min，加封闭液稀释处理HRP标记为二抗（1∶2000），在4℃的环境下过夜放置，TBST洗膜时间3×30 min，通过爆光使其显色。
　　1.6体外血脑屏障模型实验
　　HBMEC细胞的培养。差速离心法离心，A549细胞培养上清，收集、获得Exosomes。把Transwell置于一个24孔板中，在小室上层种入1×105个HBMEC细胞，在下层位置加入500 μl含有浓度为10%的胎牛血清DMEM培养基，在37℃的环境中放入CO2培养箱进行过夜培养处理，在确定能够观察到HUVEC已经长成较为完整的单细胞层之后可以进行下一步操作。取人非小细胞肺癌细胞，制成浓度为2×105个细胞/ml的单细胞悬液。将已经完全铺满HBMEC细胞Transwell小室，將其置入到新的24孔板当中，在小室的上层位置加入剂量为200 μl的细胞悬液，在下层位置加入剂量为500 μl的无清培养基及加有10×103、100×103经过离心处理之后获得的Exosomes，注意下层位置的培养液和小室间需要气泡的产生，每个样本均需要做3个复孔。37℃恒温，CO2培养箱内培养12 h。终止培养，将培养的小室取出，采用棉签擦去Transwell膜靠近内室面细胞。将Transwell小室置入到加有浓度为4%多聚甲醛24孔细胞培养板当中，在室温条件下对Transwell膜上细胞进行固定处理3 h左右。将小室取出之后采用PBS进行2次漂洗，置于加有浓度为0.1%的结晶紫溶液的24孔细胞培养板当中，经过染色处理1 h之后进行再次漂洗，在显微镜下对细胞进行观察并计数。
　　1.7统计学方法
　　采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1 Western blot检测结果
　　crExo样品电镜下呈圆形，直径30～1000 nm。crExo样品表达Exosomes标志物蛋白CD63、CD9，对albumin表达较为轻微，对内质网蛋白标志物calnexin则不表达。Exosomes样品中TMEM88蛋白的表达情况详见图1。 　　2.2 BCA检测结果
　　采用BCA法检测非小细胞肺癌细胞株的血清crExo浓度，结果提示，晚期crExo蛋白浓度为（21.51±7.03）mg/ml，显著高于早期的（13.46±5.67）mg/ml，差异有统计学意义（t=21.4534，P<0.05）。
　　2.3体外血脑屏障模型实验结果
　　染色观察细胞迁移率，结果显示，Exosomes参与了非小细胞肺癌穿过血脑屏障过程。
　　3讨论
　　非小细胞肺癌患者发生脑转移，预示着病情已经入晚期，脑转移不仅仅使患者的神经、认知、情感、生活能力等多个方面出现障碍，同时会对生存造成严重影响[4]。对于多发脑转移瘤近年来临床上主要主张通过手术、全脑或立体定向放射、辅助化疗等方式进行综合治疗[5]。但由于血脑屏障的存在，使得很多化疗药物无法进入脑内发挥作用，导致非小细胞肺癌脑转移的预后仍然很差，中位总生存期不超过1年。肿瘤的侵袭转移是指上皮-间质转化，上皮表型逐渐丢失如E-cadherin，而获得间质表型如Vimentin等，肿瘤细胞与原发生长部位完全脱离之后，可以通过各种可能的途径进行进一步的转运，在与原发部位距离相对较远的器官或組织，继续进行病理性的增殖生长，形成性质完全相同的肿瘤病灶的一个过程，属于恶性肿瘤病变最为重要的一个生物学特征性表现。通过上述的治疗措施进行干预，并不能够真正意义上对非小细胞肺癌脑转移病情的发生和进展产生良性影响[6-7]。
　　目前临床及相关领域对导致非小细胞肺癌病灶脑转移发生的主要机制还不是十分的明确，忽略了肿瘤生存微环境与肿瘤病灶之间所产生的相互作用是其中最主要的一个原因[8-9]。肿瘤细胞在特定的环境下，会表现出特定的表型，主要表现为肿瘤组织结构和生长方式的特异性，造成肿瘤细胞的不断异常生长，并以特殊生长方式存在的正是肿瘤微环境给肿瘤细胞的生长所提供的便利条件[10]。如果要使肿瘤细胞的这种特有的生长方式发生改变，应该首先对能够促进其发展壮大的微环境进行干扰，只有使其所处环境发生根本性的改变，肿瘤细胞的增长态势才能够从根本上得到有效控制，因此，肿瘤病变的发生不仅与某种基因突变有关，肿瘤与肿瘤细胞间、肿瘤与正常细胞间以及肿瘤与其所处的微环境之间存在相互作用是最重要的原因[11-12]。因此，研究肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用更为重要。肿瘤细胞和非肿瘤细胞所分泌出来的多种细胞因子、生长因子、黏附分子、细胞外基质蛋白会对肿瘤微环境中的细胞间通讯起到一定的介导作用，并为癌细胞的存活和生长提供条件[13]。相关研究显示，Exosomes属于肿瘤生长微环境的重要组成部分之一，是这些分子进入到肿瘤微环境当中的一种较为主要的方式，可以对肿瘤所导致出现的免疫抑制、血管生成、转移前微环境的形成起到有效的抑制作用。在肿瘤病变的发展和转移过程中，大多数的肿瘤细胞受到免疫系统抑制的可能性较大，对免疫反应进行抑制，或逃避免疫监视，在肿瘤病变的发展过程中显得至关重要[14-21]。
　　本研究结果显示，crExo样品电镜下呈圆形，直径30～1000 nm。crExo样品表达外泌体标志物蛋白CD63、CD9，对albumin为轻微表达，对内质网蛋白标志物calnexin则不表达。非小细胞肺癌细胞株的crExoh浓度检测结果显示，晚期的浓度较早期显著升高（P<0.05）。该结果与相关文献[22-23]报道结果相似，进一步提示，制备并形态观察Exosomes，鉴定收集的培养非小细胞肺癌的上清中含有源性Exosomes。
　　综上所述，Exosomes对肿瘤的增殖、侵袭和转移等生物学行为具有重要的调控作用，非小细胞肺癌发生脑转移也受Exosomes的影响。
　　[参考文献]
　　[1]王赛斌，吕镗烽，涂军伟，等.外泌体作为非小细胞肺癌诊断标志物的研究进展[J/CD].中华肺部疾病杂志（电子版），2018，11（2）：230-234.
　　[2]聂欢，袁帅，刘庆云，等.GPC5基因在肺腺癌细胞系中的功能研究[J].第三军医大学学报，2015，37（7）：600-605.
　　[3]陈芳，张雯，宋淑霞，等.肿瘤及肿瘤基质细胞释放的外泌体对肿瘤耐药产生的影响[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2016， 23（3）：432-436.
　　[4]Yang Q，Diamond MP，Al-Hendy A.The emerging role of extracellular vesicle-derived miRNAs：implication in cancer progression and stem cell related diseases[J].J Clin Epigenet，2016，2（1）：13.
　　[5]孟祥宽.血清外泌体膜蛋白GPC1在非小细胞肺癌筛查及预后评估中的应用价值[D].长春：吉林大学，2016.
　　[6]石远凯，孙燕，于金明，等.中国肺癌脑转移诊治专家共识（2017年版）[J].中国肺癌杂志，2017，20（1）：1-13.
　　[7]臧淑月，张振成，叶伟民，等.血清HE4与CYFRA21-1，NSE联合检测在肺癌诊断中的价值[J].检验医学与临床，2016，13（1）：84-87.
　　[8]Ji Z，Bi N，Wang J，et al.Risk factors for brain metastases in locally advanced non-small cell lung cancer with definitive chest radiation[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2014，89（2）：330-337.
　　[9]李志坚，李哲，卢强，等.CA19-9、CA125、CEA及Ferritin联合检测诊断非小细胞肺癌脑、骨转移的临床价值研[J].现代生物医学进展，2014，14（19）：3729-3732. 　　[10]王彩，魏素菊，洪雷，等.319例晚期肺腺癌患者临床预后因素分析[J].肿瘤基础与临床，2016，29（3）：240-246.
　　[11]李思迪，侯信，亓洪昭，等.外泌体：为高效药物投递策略提供天然的内源性纳米载体[J].化学进展，2016，28（2）：353-362.
　　[12]梅芬，卢忠心.肺癌脑转移与血清肿瘤标志物水平的关系[J].临床与实验病理学杂志，2016，32（1）：96-98.
　　[13]张干，刘彦龙，杨艳梅，等.肿瘤衍生外泌体传递的微RNA在肿瘤进展中作用的研究进展[J].肿瘤，2016，34（12）：1161.
　　[14]金福军，曾川，张献全，等.全脑放疗联合靶向药物与单独全脑放疗治疗非小细胞肺癌脑转移疗效及安全性的Meta分析[J].中华肺部疾病杂志，2016，9（4）：366-371.
　　[15]路长红，马莉，孙增峰，等.非小细胞肺癌脑转移手术治疗预后相关因素分析[J].中华肿瘤防治雜志，2016，23（10）：677-681.
　　[16]刘芳.血清肿瘤标志物联合检测在非小细胞肺癌脑转移诊疗中的价值[J].实用癌症杂志，2017，32（4）：578-581.
　　[17]Ou SH，Ahn JS，De Petris L，et al.Alectinib in crizotinib-refractory ALK-rearranged non-small-cell lung cancer：a phase Ⅱ global study[J].J Clin Oncol，2016，34（7）：661-668.
　　[18]陈芳，张雯，宋淑霞，等.肿瘤及肿瘤基质细胞释放的外泌体对肿瘤耐药产生的影响[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2016，23（3）：432-436.
　　[19]施卫忠，卢仁泉，郭林.恶性肿瘤患者外泌体检测的研究进展[J].中国肿瘤，2015，24（10）：849-854.
　　[20]刘锐，巴一.外泌体传输 microRNA 在肿瘤研究中的进展[J].中国肿瘤临床，2016，43（10）：442-445.
　　[21]张肖肖，毕大鹏.非小细胞肺癌脑转移放化疗联合的疗效观察[J].临床肺科杂志，2015，18（3）：562-563.
　　[22]刘长红，武明花，李桂源.肿瘤细胞来源的外泌体与恶性肿瘤的进展及化疗[J].中国生物化学与分子生物学报，2014，30（6）：526-532.
　　[23]李孟娇，王浩，李庆伟.外泌体在肿瘤转移及诊疗中的研究进展[J].中国细胞生物学学报，2016，38（5）：608-615.
　　（收稿日期：2018-08-27 本文编辑：任秀兰）
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