腐婢叶营养成分分析

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　　摘要 对2个品种的腐婢叶片中的营养成分进行提取，对其中的蛋白、果胶、黄酮、多酚、可溶性糖和脂肪共6种营养成分进行了含量测定，还通过高效液相色谱法及红外光谱法分析腐婢叶片的提取物成分。结果表明，果胶是腐婢叶的主要成分，含量占20%以上，A品系腐婢叶片中果胶含量高于B品系，而蛋白、脂肪、黄酮、可溶性多糖和多酚均低于B品系。
　　关键词 腐婢叶;营养成分;含量测定
　　中图分类号 R284文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）02-0207-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.060
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Analysis of Nutrient Composition in Leaves of Premna microphylla
　　XU Liang，WANG Hui-hui，SUN Mei-hao et al （College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua，Zhejiang 321004）
　　Abstract The nutrient components in the leaves of two kinds of Premna microphylla were extracted，the contents of protein，pectin，flavonoids，polyphenols，soluble polysaccharides and fat were determined，and the components of the extracts from the leaves of Premna microphylla were analyzed by high performance liquid chromatography and infrared spectroscopy.The results showed that pectin was the main component of Premna microphylla leaves，accounting for more than 20%.Pectin content in the leaves of strain A was higher than that of strain B，while other proteins，fats，flavonoids，soluble polysaccharides and polyphenols were lower than those of strain B.
　　Key words Premna microphylla leaves;Nutritional components;Content determination
　　腐婢（Premna microphylla），又稱豆腐柴，属马鞭草科（Verbenaceae）豆腐柴属（Premna）植物。腐婢为多年生落叶灌木，一般分布于华东、四川、中南及贵州等地区，同时具有食用和药用价值，在民间一直作为野菜和草药被食用。它的茎、叶具有清热解毒的功效，可用于治疗疟疾、痢疾、泄泻等多种疾病，也可用于醉酒头痛、创伤出血和蛇虫咬伤等[1-3]。
　　在我国腐婢的资源十分丰富，并且分布地域较为广泛，但是并没有得到很好的利用。笔者对浙江衢州地区的腐婢叶片成分进行了测定分析，以期为浙西腐婢叶资源的开发提供一定的数据支持和依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　1.1.1 试材。腐婢叶片采自浙江衢州，2个品系A、B鲜叶-20 ℃保存备用。叶粉（品系A鲜叶清洗后100～105 ℃杀青2 h，60～70 ℃烘干，粉碎，过20目筛）-4 ℃保存备用。
　　1.1.2 试剂。芦丁、葡萄糖、没食子酸、半乳糖醛酸对照品;咔唑（化学纯）、福林试剂、甲醇（色谱纯）、75%乙醇、浓硫酸（优级纯）;蒽酮、三氯化铝、碳酸钠、无水乙醇、甲醇（分析纯）。
　　1.1.3 试验仪器与设备。UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津UV-2550）;BT-224S电子天平（德国赛多利斯）;KQ2200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;KDN-2C定氮仪（上海昕瑞仪器仪表有限公司）;SXT-02索式提取器（上海洪纪仪器设备有限公司）;高效液相色谱仪（美国Agilent 1260）;傅立叶红外光谱仪（美国尼高力NEXUS 670 FT-IR）。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 蛋白的提取与测定方法。采用凯氏定氮法[4-5]。称取鲜叶碎片2 g，移入干燥消化管消化后进行凯氏定氮，进行3次平行测定，取平均值。
　　1.2.2 脂肪的提取与测定方法。采用索式提取法[6]。取样后干燥并研磨，得研细的干燥样品1.36 g，将样品移入滤纸筒，放入索式提取器内进行提取。
　　1.2.3 黄酮的提取与测定。
　　1.2.3.1 黄酮对照品溶液的制备[7]。用电子天平准确称取经过120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品5 mg，加入75%乙醇溶解，定容至5 mL，混合均匀，得浓度1 mg/mL的芦丁对照品溶液，备用。
　　1.2.3.2 黄酮对照品标准曲线的绘制。用移液枪分别移取0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL“1.2.3.1”对照品溶液至容量瓶中，定容至10 mL，得浓度分别为0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mg/mL 溶液。分别用不同浓度溶液各1 mL加入1 mL的1%三氯化铝（甲醇）溶液摇匀后静置15 min，在410 nm处测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标、芦丁对照品溶液浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=7.482 3C+0.038 3（R2=0.993 9），结果表明芦丁对照品在0.04～0.09 mg/mL线性关系良好。 　　1.2.3.3 黄酮提取液的制备。取大小近似的腐婢鲜叶洗净擦干后剪成大小适宜的碎片，称取鲜叶碎片2 g，用少量75%乙醇研磨成匀浆，转移至离心管中并用75%乙醇定容到10 mL，超声波振荡提取10 min，8 000 r/min离心10 min，所得上清液即为样品提取液[8]。
　　1.2.3.4 黄酮含量的测定。取样品提取液0.1 mL，加乙醇定容到10 mL。取1 mL稀释后的样品提取液，加入1%三氯化铝（甲醇）溶液1 mL 摇匀后静置15 min，在410 nm处测定其吸光度值，进行3次平行测定，取平均值。
　　1.2.4 可溶性多糖的提取与测定[9]。
　　1.2.4.1 葡萄糖对照品溶液的制备。用电子天平准确称取10 mg葡萄糖对照品，用蒸馏水溶解，定容至10 mL，得浓度1 mg/mL葡萄糖对照品溶液，备用。
　　1.2.4.2 可溶性多糖对照品标准曲线的绘制。用移液枪分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL“1.2.4.1”对照品溶液至容量瓶中，定容至10 mL，得浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL溶液。分别取不同浓度溶液各1 mL，加入0.1%硫酸蒽酮溶液4 mL 静置15 min，沸水浴15 min，冰水浴10 min，待恢复室温后在588 nm处测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标、葡萄糖对照品溶液浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=1.075 6C-0.007（R2=0.996 9），结果表明葡萄糖对照品在0.01～0.06 mg/mL线性关系良好。
　　1.2.4.3 可溶性多糖提取液的制备。取大小近似的腐婢鲜叶洗净擦干后剪成大小适宜的碎片，称取鲜叶碎片2 g，用蒸馏水研磨至匀浆状，定容到50 mL，超声振荡10 min，8 000 r/min 离心10 min，所得上清即为样品提取液，备用。
　　1.2.4.4 可溶性多糖含量的测定。取样品提取液0.1 mL，加蒸馏水定容到10 mL。取1 mL稀释后的样品提取液，加入0.1%硫酸蒽酮溶液4 mL静置15 min，沸水浴15 min，冰水浴10 min，待恢复室温后在588 nm处测定其吸光度，进行3次平行测定，取平均值。
　　1.2.5 果胶的提取与测定[10-11]。
　　1.2.5.1 果胶对照品溶液的制备。用电子天平准确称取10 mg半乳糖醛酸对照品，用蒸馏水溶解，定容到10 mL，得浓度为1 mg/mL半乳糖醛酸对照品溶液，备用。
　　1.2.5.2 果胶对照品标准曲线的绘制。用移液枪分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mL“1.2.5.1”对照品溶液至容量瓶中，定容至10 mL，得浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL 溶液。分别取不同浓度溶液各1 mL，加入5 mL浓硫酸，75 ℃水浴15 min后取出，冷却至室温，加入0.2 mL的0.15%咔唑无水乙醇溶液摇匀。在530 nm处测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标、半乳糖醛酸对照品溶液浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=0.003 3C+0.007 2（R2=0.991 2），結果表明半乳糖醛酸对照品在0.02～0.12 mg/mL线性关系良好。
　　1.2.5.3 果胶提取液的制备。取大小近似的腐婢鲜叶洗净擦干后剪成大小适宜的碎片，称取鲜叶碎片1 g，用蒸馏水研磨至匀浆状，定容到100 mL，超声振荡10 min，8 000 r/min离心10 min，所得上清即为样品提取液，备用。
　　1.2.5.4 果胶含量的测定。取样品提取液0.15 mL，加蒸馏水定容到10 mL。取1 mL稀释后的样品提取液，加入5 mL浓硫酸，75 ℃水浴15 min，冷却至室温，加入0.15%咔唑无水乙醇溶液0.2 mL摇匀。在530 nm处测定其吸光度，进行3次平行测定，取平均值。
　　1.2.6 多酚的提取与测定[9]。
　　1.2.6.1 多酚对照品溶液的制备。用电子天平准确称取10 mg 没食子酸对照品，用蒸馏水溶解，定容到100 mL，得浓度0.1 mg/mL没食子酸对照品溶液，备用。
　　1.2.6.2 多酚对照品标准曲线的绘制。用移液枪分别移取1、2、3、4、5 mL“1.2.6.1”对照品溶液至容量瓶中，定容至50 mL，得浓度分别为2、4、6、8、10 μg/mL溶液。分别取不同浓度溶液各1 mL，加入1 mL福林试剂，摇匀后静置2 min，再加入15%碳酸钠溶液2 mL摇匀，75 ℃水浴10 min后在760 nm 处测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标、多酚对照品溶液浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=0.035 7C-0.010 7（R2=0.991 4），结果表明多酚对照品在0～10 μg/mL线性关系良好。
　　1.2.6.3 多酚提取液的制备。取大小近似的腐婢鲜叶洗净擦干后剪成大小适宜的碎片，称取鲜叶碎片2 g，用蒸馏水研磨至匀浆状，定容到50 mL，超声振荡10 min，8 000 r/min离心10 min，所得上清即为样品提取液，备用。
　　1.2.6.4 多酚含量的测定。取样品提取液0.1 mL，加蒸馏水定容到10 mL。取1 mL稀释后的样品提取液，加入1 mL福林试剂，摇匀后静置2 min，再加入15%碳酸钠溶液2 mL摇匀，75 ℃水浴10 min在760 nm处测定其吸光度，进行3次平行测定，取平均值。 　　1.2.7 高效液相色谱法分析腐婢叶片的提取物成分[12-13]。
　　1.2.7.1 提取液制备。取大小近似的腐婢鲜叶洗净擦干后剪成大小适宜的碎片，称取3份1 g鲜叶碎片，分别加入50%、80%、100%乙醇研磨成匀浆，转移至离心管中定容到100 mL，超声振荡10 min，8 000 r/min离心10 min，取上清用0.22 μm水系微孔滤膜过滤后所得溶液即为样品提取液，备用。
　　1.2.7.2 液相色谱条件。流动相A：甲醇，流动相B：水;流量1 mL/min;柱温30 ℃;检测波长210 nm;进样体积5 μL;色谱柱：Welch Ultimate XB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm。
　　1.2.8 红外光谱法分析腐婢叶片的提取物成分[14]。取大小近似的腐婢鲜叶洗净擦干后剪成大小适宜的碎片，称取2份2 g的鲜叶碎片，分别加入溶剂研磨成匀浆，移入离心管并定容至20 mL，超声振荡10 min，8 000 r/min离心10 min，保留上清与沉淀，把水提、醇提的上清与沉淀置于真空干燥箱50 ℃干燥至恒重。冷却至室温后KBr压片制样，进行红外检测。
　　2 结果与分析
　　2.1 各成分含量的测定 根据上述方法测得吸光度，代入相应标准曲线得出腐婢叶成分主要含量（表1）。从表1可以看出，2个品种3种腐婢样品中果胶含量均为最高，且远远高于其他成分含量;其次为脂肪含量，在所测各成分中均为第二，之后依次为黄酮、可溶性多糖、多酚和蛋白含量。叶粉样品中由于前期处理去掉了水分，所以各成分含量均高于其余2个样品。
　　2.2 高效液相色谱法分析腐婢叶片的提取物成分 梯度洗脱：0～40 min，15% A→90% A;40～43 min，90% A+10% B;43～45 min，90% A→15% B。不同浓度乙醇提取液的液相色谱结果见图1。从图1可以看出，在2～3 min样品A存在显著的色谱峰，而样品B的色谱峰则相对较小，样品C的色谱峰几乎不可见，说明在该时间段测出的小分子物质极性较强，导致其在乙醇浓度较低的提取液中提取效果更好，当提取液中的乙醇浓度提高时，提取效果明显下降。同理可说明在4、7～9 min处A、B、C的峰逐渐平缓。自25 min之后，3个样品的色谱曲线十分相近则是由于随着时间递进流动相中乙醇浓度升高检测出的小分子物质极性较弱。
　　2.3 红外光谱法分析腐婢叶片的提取物成分 图2为分别用蒸馏水和乙醇进行腐婢叶片成分提取后，以上清与沉淀作为样品的红外光谱图。从图中可以看出，A、B、C、D 4个样品分别在3 270、3 300、3 330和3 280 cm-1附近有强而宽的吸收峰，3 600～2 500 cm-1处的吸收峰是O—H的伸缩振动引起的，A、B、C、D 4个样品物质分子中有很多-OH;3 000～2 800 cm-1处的吸收峰是C—H的对称和反对称伸缩振动引起的，样品C物质在2 920和2 850 cm-1处的吸收峰是饱和C—H的伸缩振动; 1 760～1 720 cm-1处的吸收峰是半乳糖醛酸羧基形成的酯键（-COOR）中羰基的伸缩振动引起的，样品C在1 740 cm-1处有较强的特征吸收峰，样品A、B、D在1 740 cm-1处有较弱的特征吸收峰;在1 680～1 600 cm-1 处的特征吸收峰由游离的羧酸（-COOH）中羰基的不对称伸缩振动引起的，样品A、B、D在1 620 cm-1处有较强吸收峰，样品C在1 620 cm-1处有较弱吸收峰;1 400 cm-1是羧基中C—O的伸缩振动、1 200 cm-1是羧基中O—H的弯曲振动;1 010～1 040 cm-1是吡喃型糖环的醚键和羟基的吸收。A、B、D样品是存在果胶分子物质，而C样品是乙醇提取上清的物质分子，红外光谱结果与文献[15]基本一致。
　　3 结论
　　该研究初步测得2种腐婢叶片品系营养成分蛋白、脂肪、黄酮、可溶性多糖、果胶及多酚的含量。其中A品系腐婢叶片中蛋白含量为0.061 9%，脂肪含量为8.84%，黄酮含量1.82%，可溶性多糖含量0.81%，果胶含量为24.46%，多酚含量为0.64%;B品系腐婢叶片中蛋白含量為0.067 7%，脂肪含量为9.56%，黄酮含量2.16%，可溶性多糖含量1.00%，果胶含量为23.40%，多酚含量为0.71%。
　　该研究对腐婢叶片中6种营养成分进行了含量测定分析，果胶是其主要成分，含量高达20%以上，为腐婢叶资源的进一步开发和利用奠定了基础，可根据其富含果胶进一步开发成果冻类食品或作为食品果胶添加剂。
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