4种稗属杂草对二氯喹啉酸等常用除稗剂的抗药性

来源:用户上传      作者:谷涛 李永丰 杨 霞 张自常 曹晶晶 杨倩

　　摘要：稗属（Echinochloa spp.）雜草严重影响我国水稻安全生产。二氯喹啉酸作为主要的除稗剂，连续施用多年，抗性问题突出。为进一步探明稗草对二氯喹啉酸等除稗剂的抗性现状，以便有针对性地进行抗性治理，对采集于江苏省稻区的稗草种群进行抗性分析。结果表明，采自常州市金坛区金城镇、南京市六合区和镇江市句容市的稗草种群对二氯喹啉酸抗性频率分别为25.93%、30.53%和22.6%，采集于其他几个地区的稗草种群抗性频率在4.69%～9.71%之间。对分离筛选到4种抗性稗草进行抗性水平测定，整株生物测定结果表明，普通稗EB-S和EB-R的GR50（生长抑制中量）值分别为194.85和4 483.33 g a.i./hm2，普通稗抗性材料（EB-R）的抗性指数达到了23，EB-R对二氯喹啉酸产生了较高水平的抗药性。孔雀稗（ES-R）、西来稗（EZ-R）和无芒稗（EM-R）对二氯喹啉酸的抗性指数分别为8.87、9.32、7.41，处于中等水平抗药性。另外，普通稗（EB-R）和西来稗（EZ-R）对双草醚和氰氟草酯产生了一定的抗（耐）药性，无芒稗（EM-R）对唑酰草胺产生了一定的抗（耐）药性。本研究结果可为通过轮换用药治理抗性杂草提供理论依据。
　　关键词：稗草种群;二氯喹啉酸;抗性频率;稗草;抗性水平;除稗剂
　　中图分类号：S451
　　Abstract：Echinochloa spp. have serious impacts on Chinas rice production. Quinclorac，as an effective herbicide，has been used for controlling Echinochloa spp. for many years worldwide，but quinclorac-resistant populations of Echinochloa spp. have become very serious. To further investigate the resistance status of Echinochloa spp. to quinclorac，Echinochloa spp. populations were collected in different rice-planting areas in Jiangsu Province. Quinclorac-resistance frequencies in Jincheng Town，Jintan District of Changzhou City，Luhe District of Nanjing City and Jurong City of Zhenjiang City were 26%，30% and 23%，respectively，while those from other districts ranged from only 4.7% to 9.7%. Moreover，the resistance levels of four Echinochloa species （Echinochloa crusgalli，Echinochloa crusgalli var. zelayensis，Echinochloa cruspavonis，Echinochloa crusgalli var. mitis） to quinclorac were determined. GR50 values derived from whole plant bioassays for EB-S and EB-R populations were 195 and 4 483 g a.i./hm2
　　Key words：Echinochloa spp. populations;quinclorac;resistance frequency;Echinochloa spp.;resistance level
　　我国水稻种植历史悠久，种植面积辽阔。2017年我国稻谷的种植面积为3 074.7万hm2，约占农作物总播种面积的18.49%[1]。我国有65%以上的人口以大米为主食[2]，水稻种植是农民的主要收入来源之一，因此水稻的安全生产至关重要。长期以来，草害问题都是困扰水稻高产、稳产的主要因素。我国田间杂草种类繁多，危害程度严重。杂草不仅和水稻竞争水分和肥料等物质条件，还和水稻竞争光源、二氧化碳等自然资源，同时杂草还是病虫害传播的重要媒介，因此对水稻产量和品质造成显著的影响[3-5]。以稻田最常见恶性杂草——稗草为例，当稗和光头稗密度分别为9株/m2和280株/m2时，水稻产量分别下降57%和76%[6];当无芒稗（Echinochloa crusgalli var. mitis）、稗（E. crusgalli var. crusgalli）、西来稗（E. crusgalli var. zelayensis）和光头稗（E. colonum）的田间密度为6株/m2时，无芒稗、稗、西来稗处理分别导致籼稻产量下降19.2%、10.8%、21.9%，导致粳稻产量分别下降39.7%、25.3%、47.3%[7]。
　　目前，杂草防除主要依靠化学除草剂，我国是化学除草剂的生产和使用大国。仅2016年，我国除草剂销售额就达19.72亿美元，占农药销售额的40.9%，超过杀虫剂、杀菌剂，居农药销售之首[8]。市面上比较常见的除稗剂有二氯喹啉酸、五氟磺草胺、双草醚、氰氟草酯、唑酰草胺等，但稗草对上述除草剂均产生了不同程度的抗药性，多个国家先后报道了稗草对激素类、ALS（乙酰乳酸合成酶）抑制剂类、ACCase（乙酰辅酶A羧化酶）抑制剂类、氯乙酰胺类、二硝基苯胺类、脲类/酰胺类、硫代氨基甲酸脂类等除草剂产生抗药性的情况[9]。抗性稗属杂草已呈现从单一靶标的单抗性向抗2种或多个以上作用靶标的多抗性发展的态势，随着化学除草剂的长期持续使用，“超级抗性稗草”将成为现实[9]。二氯喹啉酸上市以来，被大量使用，稗草对其抗药性尤为突出。早在1997年，在西班牙南部单季稻区就发现2种抗二氯喹啉酸的稗草生物型R、I，抗性指数分别为26、6[10];2007年，在美国阿肯色州的稻田中发现了兼抗敌稗和二氯喹啉酸的稗[11];2010年，在马来西亚发现了对敌稗、氰氟草酯、二氯喹啉酸产生抗药性的多抗性稗草，抗性指数分别为4、17、10[12];2010年，在我国稻区发现了兼抗二氯喹啉酸与双草醚的多抗性稗草种群[13]。2013年，我国研究人员从不同地区采集多个西来稗种群，测定发现其中多个种群对二氯喹啉酸产生了抗药性[14]。伴随着农业生产向规模化、集约化方向转变，一些田埂杂草逐渐进入田间，加上单一化学除草剂的频繁使用，杂草的抗药性问题已不容忽视;尤其曾经的优良除稗剂——二氯喹啉酸，其抗性已发展成“逢稗必抗”的境地，因此有必要对其抗性进行研究。本研究基于这一出发点，首先对采集的稗草材料进行抗性鉴定，然后着重对4种稗草的抗性水平进行了分析，最后对其抗性模式进行了研究，以期为抗性杂草的科学治理提供依据。 　　1 材料与方法
　　1.1 試验材料
　　2014—2015年度，在江苏省常州市金坛区、南京市六合区、南京市溧水区、江苏省镇江市等地进行稗草采集，共采集1 280个稗草种群，其中金坛区327个种群，六合区262个种群，溧水区320个种群，镇江市371个种群。4种稗草材料（8个生物型，抗/感）为孔雀稗（ES-R/S）、普通稗（EB-R/S）、西来稗（EZ-R/S）、无芒稗（EM-R/S）。
　　1.2 供试药剂
　　50%二氯喹啉酸可湿性粉剂、20%双草醚悬浮剂（江苏省激素研究所股份有限公司）;2.5%五氟磺草胺可分散油悬浮剂、10%氰氟草酯乳油（美国陶氏益农公司）;10%唑酰草胺乳油（苏州富美实植物保护剂有限公司）（表1）。
　　1.3 试验设计和方法
　　1.3.1 抗性材料的筛选 田间收集的稗草种子（F0代），晾晒编号后，在电子防潮柜中保存。筛选时，将稗草在秧盘中播种，秧盘大小为0.54 m×0.28 m，每个秧盘4×8个孔。秧盘装土浸水后，每孔播种饱满且大小均匀一致的稗草种子50粒，4次重复。稗草2～3叶期时，用喷雾器喷施推荐剂量（1倍，375 g a.i./hm2）的二氯喹啉酸。3周后观测稗草的存活状态并记录，存活的稗草分单株移栽于盆钵中，常规水肥管理。待稗草抽穗后，观测记录稗草的形态特征。稗草成熟后，分单株收获种子（F1代）。
　　1.3.2 遗传背景趋于一致敏感性材料的分离 抗性材料（F1代）单株种植（50株），产生3～4个分蘖后，将分蘖拨离主茎单独移栽。来源于同一植株的分蘖分成2个部分，用2个剂量浓度（1倍和4倍）的二氯喹啉酸处理。主茎不处理，用作留种。若在1倍的二氯喹啉酸剂量浓度下死亡，则主茎为敏感性材料（F2代）;若在4倍的二氯喹啉酸剂量浓度下存活，即为抗性材料（F2代）。
　　1.3.3 整株法测定稗草种群的抗性水平 挑选颗粒饱满且成熟的稗草种子（F2代），放入铺有2层滤纸的培养皿中，倒入适量的蒸馏水后，置于智能光照培养箱中培养催芽（光照度为10 000 lx，光照黑暗比为14 h ∶ 10 h;温度为白天30 ℃、夜间25 ℃）。稗草种子出芽后，人工播种于装有混合营养土（蛭石 ∶ 营养土 ∶ 石英砂=1 ∶ 2 ∶ 1）的塑料杯中，每杯40株，细土盖种。处理完毕后，置于光照培养箱中培养，培养条件同催芽，正常水肥管理，不定时移动塑料杯位置。待稗草长至1～2叶期时定苗，每杯留长势一致的稗草苗20株，3～4叶期时用二氯喹啉酸对茎叶进行喷雾处理。各生物型喷施除草剂剂量见表2，各处理重复4次。21 d 后观察记录稗草死亡情况，并剪下植株的地上部分称鲜重。喷雾采用农业农村部南京农业机械化研究所生产的3WPSH-500D型生测喷雾塔，圆盘直径为50 cm，主轴转动速度为6 r/min，喷头孔径为0.03 cm，喷雾压力为0.3 MPa，雾滴直径为 100 μm，喷头流量为90 mL/min。
　　1.3.4 不同生物型稗草对其他除草剂的抗性 4种稗草的8种生物型材料，分别喷施五氟磺草胺、双草醚、氰氟草酯、唑酰草胺等除草剂，验证其对常见除稗剂的抗（耐）药性。具体过程如下：在塑料杯中装入混合营养土（蛭石 ∶ 营养土 ∶ 石英砂=1 ∶ 2 ∶ 1），每杯播入稗草种子30～50粒，上面覆盖1层细沙土。在稗草出苗后至1叶1心时，人工间苗，每杯留长势一致的幼苗15株。待幼苗长至2叶1心期时，放入3WPSH-500D型生测喷雾塔喷施除草剂，各药施用剂量见表1。另设清水作空白，每个处理重复4次。药后21 d，记录稗草的存活状态，统计各生物型稗草的死亡率。
　　1.4 数据分析
　　采用Excel 2003、Sigmaplot12.3软件对试验数据进行统计分析。生测试验中，数据处理使用Seefeldt等描述的双逻辑非线性回归模型[15]进行，求出种群的GR50值，计算抗性指数RI，具体公式如下：Y=C+D-C1+XGR50b。
　　式中：Y为特定除草剂剂量下所测杂草地上部分干重相对于不喷药对照的百分数;X为除草剂的用量;C为剂量反应下限;D为剂量反应上限;GR50为生长抑制中量;b为斜率。抗性指数（RI）=抗性种群GR50/敏感种群GR50。
　　2 结果与分析
　　2.1 稗草材料对二氯喹啉酸的抗（耐）药性鉴定结果
　　对采自各地稻田的1 280个稗草种群进行抗性筛选，结果（表3）表明，采集于金坛区金城镇的108个种群、南京市六合区的262个种群和镇江市句容市的323个种群，在喷施二氯喹啉酸后，分别有28、80、73个种群存活且保持良好的生长状态，表明这些种群对二氯喹啉酸产生了抗（耐）药性，抗性材料占各材料的比例分别为25.93%、30.53%、22.6%。采集于金坛区直溪镇的116个种群、金坛区薛埠镇的103个种群、南京市溧水区的320个种群、镇江市丹徒区的48个种群中分别有10、10、15和3个种群对二氯喹啉酸产生了抗（耐）药性，占各自采集材料的8.62%、9.71%、4.69% 和6.25%，说明这些地区稗草对二氯喹啉酸的抗药性处于初发阶段，抗性种群尚未发展为优势种群。总体上来看，在所有采集的1 280个稗草种群中，抗（耐）二氯喹啉酸的稗草种群为219个，所占比例为17.11%。
　　2.2 从抗性材料中分离筛选出对应的敏感性材料
　　抗性材料与敏感性材料的遗传背景对抗性水平的鉴定和抗性机制研究非常重要，若选择的敏感性材料不同，则抗性材料的抗性水平可能存在差异，抗性机制可能难于解释[16]，尤其是研究生态适合度，对抗敏性材料的来源有严格的要求，否则材料背景的差异会影响研究结果的准确性[17]。分离筛选结果表明，50株孔雀稗植株中，最终有49株存活，存活材料中敏感性材料有10株，抗性材料有39株;普通稗植株中敏感性材料有8株，抗性材料有37株;西来稗中敏感性材料有16株，抗性材料有34株;无芒稗中敏感性材料有6株，抗性材料有41株。通过此方法，成功地筛选到各自对应材料的敏感性材料，并将其对应的分别命名为 ES-S、EB-S、EZ-S和EM-S。 　　2.3 4种不同稗草对二氯喹啉酸的抗性水平确定
　　以分离筛选获得的4种稗草的抗性和敏感生物型材料（ES-S/R、EB-S/R、EZ-S/R和EM-S/R）为研究对象，研究不同种稗草对二氯喹啉酸的抗性差异。整株水平测定结果表明（表4、图1）：ES-S的GR50为171.25 g a.i./hm2，ES-R的GR50为1 519.23 g a.i./hm2，ES-R和ES-S的GR50比值（RI）为8.87，说明ES-R对二氯喹啉酸产生了中等水平的抗药性。EB-S和EB-R的GR50分别为194.85和4 483.33 g a.i./hm2，供试普通稗的抗性材料的抗性指数达到了23.00，这一结果表明，抗性普通稗种群EB-R对二氯喹啉酸产生了较高水平的抗药性。西来稗抗性材料EZ-R和无芒稗抗性材料EM-R对二氯喹啉酸的抗性指数分别为9.32和7.41，处于中等水平抗药性。
　　2.4 不同生物型稗草对主要除稗剂抗性模式分析
　　对筛选获得的8种生物型稗草的抗性谱进行研究（图2），发现孔雀稗的所有处理中，除了清水对照以外，其他处理死亡率均较高，说明孔雀稗材料（ES-R、ES-S）对供试的4种除草剂均敏感。普通稗敏感生物型EB-S、西来稗敏感生物型 EZ-S 和无芒稗敏感生物型EM-S对4种除草剂均敏感。普通稗抗性生物型EB-R和西来稗抗性生物型EZ-R对五氟磺草胺和唑酰草胺敏感，但对双草醚和氰氟草酯产生了一定的抗（耐）药性。普通稗抗性生物型EM-R对唑酰草胺生产了一定的抗（耐）药性，对五氟磺草胺、双草醚和氰氟草酯敏感。
　　3 小结与讨论
　　二氯喹啉酸属于合成激素类除草剂，自20世纪90年代中期我国开始大面积推广应用以来，由于高效、安全、经济等特点，被广泛用来控制稻田稗草。稗草是稻田最常见杂草，属多倍体植物，除草剂作用靶标基因有多个拷贝，由于“稀释效应”的影响，理论上稗草对除草剂产生抗性较为不易，产生高抗表型更为困难[18]。但是大量的文献报道和实际调查结果表明，目前稗草对多种除草剂产生了抗药性[19-22]，尤其是对二氯喹啉酸产生了较高的抗性水平。究其原因，可能与稗草生物学特性有关。稗草种子产量巨大、随熟随落，生长迅速、代谢活跃[23-24]，这些特征有助于突变基因或抗性因子的累积，从而使稗草在快速迭代繁殖中產生抗药性。本研究中筛选到了孔雀稗、西来稗、普通稗和无芒稗4种稗草抗性材料，通过“无性克隆”的方法筛选到了对应的敏感性材料[25-26]，并对其抗药性水平进行了研究。结果表明，4种稗草的抗性生物型EB-R、ES-R、EZ-R、EM-R对二氯喹啉酸的抗性指数分别为23、9.32、8.87和7.41。但几种稗草对二氯喹啉酸的抗性机制还须进一步研究。本研究中获得的材料为系统地研究稗草对二氯喹啉酸抗性机制及不同稗草种对二氯喹啉酸抗性机制差异提供了充分的材料。
　　本研究中的稗草样品主要采集于南京市及其周边，在当地农科院、植保站的协助下采集。采样地点位于杂草发生较重的区域，采样时对采样点用药历史进行了详细记录。结果表明，大多数抗性材料的采样地点均有过二氯喹啉酸的用药历史，这与外部的选择压力是杂草抗药性进化的驱动力这一论述相符[27]。江苏省常州市金坛区金城镇采集的108个种群、南京市六合区采集的262个种群、镇江市句容市采集的323个种群对二氯喹啉酸的抗性发生频率均在20%以上，表明这几个地区稗草对二氯喹啉酸的抗药性已经非常普遍，二氯喹啉酸在这几个地区须慎重使用。普通稗抗性生物型EB-R和西来稗抗性生物型EZ-R对双草醚和氰氟草酯产生了一定的抗（耐）药性，但对五氟磺草胺和唑酰草胺敏感，因此可选用五氟磺草胺和唑酰草胺来控制此抗性稗草。EM-R对唑酰草胺产生了一定的抗（耐）药性，对其他3种供试除草剂敏感。五氟磺草胺和双草醚属于ALS抑制剂类除草剂，唑酰草胺和氰氟草酯属于ACCase抑制剂类除草剂，EB-R和 EZ-R对双草醚和氰氟草酯产生抗药性，但对五氟磺草胺和唑酰草胺敏感，说明EB-R和EZ-R抗药性的产生可能属于非靶性抗性（即代谢相关抗性）。对杂草的抗性模式进行研究，不仅对杂草抗性治理有帮助，同时还可对杂草的抗性机制进行初步判断。目前，国内外对稗草的抗药性研究是一个热点，但较少从防治的角度研究，因此有必要深入研究杂草的抗性谱，以及多抗药性的协同机制。有理由相信，随着杂草抗药性机制逐步解析和综合防控技术的发展应用，我们必能兴利除弊，并最终变弊为利。
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