草鱼免疫基因研究进展

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　　摘要：鱼类疾病抵抗力与健康养殖及可持续发展密切相关，而免疫系统在鱼类的疾病防御及其免疫调控中发挥着重要作用。大量研究表明，通过各类免疫因子及其相关通路来调节免疫系统，可以达到有效对抗各类外源性微生物的目的。本文从基因表达变化角度对草鱼部分免疫相关因子及相关调控因子，对草鱼免疫基因研究进展进行概述。
　　关键词：草鱼;免疫因子;Toll样受体;免疫系统;疾病病害;健康养殖;可持续发展
　　中图分类号： S965.112;S917
　　文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）02-0046-06
　　收稿日期：2018-10-13
　　作者简介：陈继楚（1993—），女，湖北武汉人，硕士研究生，主要从事水产增养殖研究。E-mail：865616952@qq.com。
　　通信作者：陈成勋，研究员，主要从事水产增养殖研究。E-mail：ccxnxy@163.com。
　　鱼类免疫系统包括特异性免疫和非特异性免疫，在系统发育上，特异性免疫比非特异性免疫形成晚，在自身对病原微生物抵抗的过程中，非特异性免疫系统发挥了更大的作用[1]。非特异性免疫与生俱来，在面对入侵性外源微生物时反应迅速，如免疫细胞保护机体的过程中，凝集素、调理素、溶菌酶和补体等可以辅助其进行识别、黏附及共价结合，细胞膜上的Toll样受体等通过识别病原微生物相应的膜蛋白和脂多糖等，向下游的相关蛋白及蛋白激酶等传递信号，最终使细胞产生白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、转生长因子等非特异性免疫因子，进行稳定且迅速地排斥异己、清除和杀灭病原微生物[2]。在特异免疫反应中，外源微生物入侵后，部分未被非特异性免疫系统处理的胞外抗原、各种抗原呈递细胞处理后的产物，机体通过激活特异性免疫系统，由此产生对应的免疫球蛋白来进行特异性清除[3-4]。
　　鱼类免疫系统的正常运行都依赖各类免疫基因的表达、转录及各种相关通路的调控，通过研究不同条件下机体各组织差异基因的时序表达，可进一步验证免疫基因及其表达的信号因子与各类疾病的相关性，从而为鱼类疾病防治及免疫方向的研究奠定基础[5-6]。
　　草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国传统养殖的四大家鱼之一，一直以来作为国内淡水养殖的主要品种，具有生长快、饲料成本低、蛋白利用率高等优点[1]，但草鱼的抗病力较差、成活率低、养殖过程中易患草鱼出血病、烂鳃病、赤皮病和肠炎病等，疾病频发在一定程度上不仅对生产养殖造成了较为严重的损失，也制约了草鱼的健康养殖和可持续发展。在对疾病防治进行探索的过程中，除加强日常管理与提高养殖技术外，还可通过研究鱼体免疫系统，了解机体自身的免疫功能，增强抗病防御能力[2]。疾病病害已经长期制约了草鱼的健康养殖，使得免疫防治及疾病方向的研究也逐渐受到各方学者重视，因此针对免疫相关因子的研究也具有重要的现实意义。迄今为止，有关草鱼抗病防御机制的研究已有诸多报道，部分免疫相关基因的序列被克隆，不同条件下基因表达谱及相关免疫调控产物等均进行了部分研究[7-8]，本文对草鱼部分免疫因子的基因表达研究进行概述，旨在为草鱼的疾病防治提供参考。
　　1 Toll样受体TLRs
　　Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一类重要的参与机体非特异性免疫的相关非催化性蛋白。它可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子，部分未被识别的外源微生物及激活机体产生免疫应答反应;Toll样受体也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁[9]。至今在硬骨鱼类中已经发现了17种TLR基因（T1、2、3、4、5、7、8、9、13、14、18、19、20、21、22、23、27），其中TLR（13、14、19、20、21、22、23）为鱼类所特有[10-11]。哺乳类的TLR4可识别LPS，但鱼类的TLR4不具有识别LPS的功能且目前仅在部分鲤科鱼类中被鉴定到[10]。
　　目前，已研究的草鱼TLR基因相关报道中，杨春荣等发现健康草鱼的TLR9基因在血、脑、眼、鳔、脾、肌肉、皮肤、肝胰脏、头肾、中肾、鳃、肠和心脏组织均有所表达，在鳃组织中表达量最高，血和头肾表达量次之[12]。黄吉文应用嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染草鱼后，转录组分析发现20种TLR基因，即TLR（1、2、3、4.2、4.3、4.4、5a、5b、7、8a、8b、9、13、18、20.1、20.2、21、22、25、27）;脾脏转录组分析显示感染后72 h内，14个基因表达无差异，有6个TLR基因显著上调，即TLR（5a、5b、202、21、22、27），其中TLR（5a、5b）和TLR20.2在感染48 h上调最为显著且呈现先升后降的趋势，TLR21在感染72 h上调最为显著，TLR（22、27）在感染12 h上调最为显著;TLR27基因为草鱼中首次发现，其目前仍未被明确按结构域归类确定其所属TLR亚家族。通过体外诱导刺激草鱼CIK细胞系，经鼠伤寒沙门菌的鞭毛蛋白（FLA-ST，flagellin from Salmonella typhimurium）、脂多糖LPS，（lipopolysaccharide）及聚肌苷酸[Poly（I：C），polyinosine-polycytidylic acid]誘导后发现TLR18基因表达量均呈现先升高后降低的趋势;经LPS及Poly（I：C）诱导后TLR20.2基因表达量呈现先升后降趋势，经FLA-ST诱导后呈现先降后升再恢复正常的趋势;TLR21基因表达量经LPS及FLA-ST诱导后显著先升后降趋势[13]。草鱼感染柱状黄杆菌（Flavobacterium cloumnare）后发现，7 d内TLR3、TLR7、TLR 22 3种基因的表达量均呈现不同程度的显著上调变化[14]。 　　杨春荣等使用草鱼出血病呼肠孤病毒GCRV（reovirus of grass carp）感染草鱼后120 h，发现24 h时肝胰脏中TLR3基因表达量显著高于正常水平，48 h时恢复至正常水平[15-16]。李青梅使用GCRV攻毒草鱼后72 h，其中肾组织中TLR3基因表达量 6～72 h 内持续显著上调;TLR7基因的表达量在 12～72 h内持续显著上调;TLR22基因表达量在 72 h 内持续显著上调[17]。王文静研究了经GCRV诱导后1～7 d的草鱼发现，其肝胰脏中TLR18基因在4 h显著上调，脾脏中3 d内表达水平显著上调后7 d显著下降，TLR20基因在肝胰脏中显著下调，在脾脏中显著下调4 h后上调至高表达水平，在鳃和肾脏中表达水平较高，TLR21基因在肝胰脏和脾脏中的表达量显著下调;经嗜水气单胞菌诱导后1～7 d，TLR18在肝胰脏中表达水平呈现抑制，在脾脏中诱导4 h和7 d 2个时间点呈现抑制状态，TLR20基因在肝胰脏中4 h内迅速上升后开始下降，在脾脏中 3 d 内逐渐上升后至7 d显著被抑制，而在肾脏和鳃中表达水平相对较高，TLR21基因在肝胰脏和脾脏中的表达量显著上调[18]。草鱼感染GCRV后，发现其脾脏和头肾组织中的TLR8基因呈现先抑制再上调后恢复正常水平的趋势，陈晓慧对比斑马鱼（Barchydanio rerio var.）及虹鳟（Oncorhynchus mykiss）相关基因序列，成功检测并克隆到草鱼的TLR8序列，之后分析鱼体感染嗜水气单胞菌72 h内不同时间点TLR8基因的情况，发现脾脏中TLR8基因呈现6 h内先下调后12～24 h上升至顶峰，72 h 恢复正常的趋势[14]。
　　张小平通过在养殖水体中投放枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及施氏假单胞菌（Pseudomonas）的复合菌微生态制剂，发现15 d后草鱼肝胰脏中TLR3、TLR7基因表达量显著提升;肠黏膜中TLR3基因表达量升高，TLR7基因表达量降低[19]。徐晓雁使用嗜水气单胞菌感染草鱼后经发现0～7 d 内，TLR4基因的表达量在脾脏中持续上升，在肾脏中表达量则无显著性差异;TLR5基因的表达量在脾脏和肾脏中均呈现先降低后升高的趋势[11]。李雪吟使用不同浓度赖氨酸饲料饲喂草鱼56 d后，使用LPS处理草鱼肠道上皮细胞，经研究发现TLR3、TLR4的表达水平均显著上调[20]。2 髓样分化因子
　　髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是依赖于MyD88的TLR信号通路中的关键接头分子，在传递上游信息中具有重要的作用[21]。鱼类相关研究中，最初在斑马鱼中鉴定到MyD88并克隆，其与人、小鼠、非洲爪蟾具有较高的同源性[22]。在多种组织器官中均有表达，在肠、脾及肝胰脏中表达量为相对较高[23]。目前，已有不少学者对草鱼的该基因做过相关研究，董捷发现，GCRV感染草鱼后120 h，其肌肉、皮肤、肝胰脏、头肾、中肾、鳃、肠、脾脏和心脏等组织中MyD88基因表达量均有不同比例上调，其中肝胰脏中MyD88基因表达量呈现先升，至72 h后降，120 h再升高趋势，脾脏中表达量在24 h时升到最高值后开始下降，72 h下降至正常水平，120 h时再次上调[24]。陈晓慧使用GCRV刺激草鱼后，发现脾组织和中肾组织中MyD88基因的表达量在24 h内显著上调[14]。李青梅使用GCRV攻毒草鱼后72 h内，发现中肾中MyD88基因表达量在0～6 h内先降低后升高，12 h达到最大表达量后开始降低，72 h恢复正常水平无显著差异[17]。李雪吟使用不同浓度赖氨酸饲料饲喂草鱼56 d，再LPS处理草鱼肠道上皮细胞后，经研究发现MyD88表达水平显著上调[20]。
　　3 肿瘤坏死因子和白细胞介素
　　Toll样受体介导的信号通路下游常见免疫相关因子中，通过NF-κB经典信号通路进行活化后信号传递，所产生的肿瘤坏死因子及白细胞介素，是两大类重要的促炎症因子及免疫调节相关分子。
　　肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）是一种可以由多种免疫细胞产生的小分子蛋白质，具有杀伤肿瘤细胞、进行免疫调节和诱导白细胞迁移、分化、增殖及凋亡等功能，主要通过其基因表达形成受体及一系列相关因子发挥功能[25]。使用LPS体外刺激处理草鱼120 h内，12 h时脾脏组织中TNF-α基因表达水平出现明显的上调[26-27]。吴宗凡使用不同浓度的对羟基苯乙酰胺（4-hydroxybenzeneacetamide）和环（甘氨酸-脯氨酸）二肽刺激草鱼CIK肾细胞，分析后发现24 h内TNF-α基因表达量显著上调[28]。吴春燕等在草鱼的高脂饲料中添加不同浓度的景天科中草药植物垂盆草（Sedum sarmentosum）水提取物，连续投喂饲料42 d后发现，1 200 mg/kg剂量组肝胰脏中TNF-α基因表达量显著低于同期的高脂组[23]。
　　白细胞介素（interleukin，IL）是一类由淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞产生的重要细胞因子，其在维持机体免疫功能和炎症反应过程中发挥极其重要的作用。系统发育分析已经证明，IL-1家族的有限几种成员和受体在硬骨鱼类中存在直系同源物。IL-1是早期促炎症反应细胞因子中枢性的一个并诱导级联效应，通过上调或下调其他细胞因子来间接地介导，最终导致炎症反应[29]。目前，学者们已经在13种硬骨鱼类中发现并鉴定了IL-1β因子的基因表达，它通过刺激T细胞来调节免疫，类似于哺乳动物中IL-1β的作用。而硬骨鱼类的IL-1β又区别于蛙类、鸟类及哺乳动物的IL-1β[30]。使用嗜水气单胞菌感染草鱼后发现，其肠道中的7个白细胞介素相关基因（IL-10、IL-10Rα、IL-10Rβ、IL-2RG、IL-17R、IL-22、IL-23）在致炎1 d后表达量上调至最高水平;IL-12p40、IL-12Rβ2基因在3 d上调至最高;IL-23R、IL-6基因則在致炎后3 d显著上调，而IL-21在致炎后3 d显著下调[31]。徐炳森研究表明，伴刀豆球蛋白（concanavalin，Con A）可诱导草鱼的头肾淋巴细胞白细胞介素IL-2基因的表达[32]。王尚念使用嗜水气单胞菌攻毒草鱼72 h后发现，IL-1β基因在肾脏、脾脏和头肾组织中表达较高[33]。张小平通过在养殖水体中投放枯草芽孢杆菌及施氏假单胞菌的复合菌微生态制剂发现，15 d内草鱼肝胰脏中IL-8基因表达量显著升高，IL-1β显著降低肠黏膜中IL-8基因表达量显著降低[19]。李雪吟使用不同浓度赖氨酸饲料饲喂草鱼56 d，再使用LPS处理草鱼肠道上皮细胞后发现，IL-1、IL-8基因表达量显著上升[20]。 　　4 干扰素及其调节因子
　　干扰素（interferon，IFN）是一类重要的细胞功能糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫系统等功能，其转录调控因子为干扰素调节因子（interferon regulatory factors，IRF），其中常见的有IRF1、IRF3、IRF5、IRF7。干擾素及其相关调节因子是鱼类抵御病毒入侵的重要组成之一[34-37]。
　　草鱼干扰素最初是由邵健忠等开始探究[38-41]，通过GCRV病毒诱生后分离纯化得到草鱼血清中一种高效价的抗病毒活性物质，鉴定为干扰素[39]，进一步研究免疫调节功能，发现草鱼的干扰素是由头肾、脾、肾、外周血和胸腺组织的T淋巴细胞产生的，可以经病毒体外诱导产生α/β干扰素[40-41]。Zhang等通过体外细胞培养草鱼肾细胞系CIK，并从中鉴定出抗病毒的干扰素基因[42-43]。李青梅使用GCRV攻毒草鱼后发现，72 h内中肾中IFN-I的表达量在6～72 h内呈现持续上调趋势[17]。许巧情等研究发现，经柱状黄杆菌诱导后IRF-5基因表达量在受精卵中呈现先升后降的趋势，推测未受精卵中存在IRF-5母源mRNA表达，随着胚胎发育，其免疫防御机制逐渐完善[44]。仔鱼出膜后，IRF-5的表达量又开始上调且维持在一定数量，推测母源性该基因在早起胚胎发育以及抵抗外源病毒和细菌的侵染方面发挥重要作用，通过母源基因的保护，草鱼胚胎免疫系统逐渐发育至完全[45]。王伟等还曾根据前人的研究，克隆出IFN上游的一种起调节诱导的抗病毒基因Mx（myxovirus rsistance）并将其在草鱼肝胰脏中进行了表达[46]。
　　5 补体
　　补体（complement）主要由肝细胞和巨噬细胞产生，常以无活性形式存在于正常血清和体液中的一组蛋白质，共有20多种，由特定的补体基因编码而成[47]。补体本身没有特异性，不能和游离的抗原或抗体结合，只能与抗原抗体复合物进行结合，主要作用是在一定条件下进行一系列酶促级联反应，在机体抵抗细菌侵染的免疫应答过程中，通过补体激活，活化淋巴细胞，对鱼类健康生长发育起重要作用[48-55]。
　　目前，硬骨鱼类中补体C（1、2、3、4、5、6、7、8、9）的成分及其性质和功能等大多都已明确，而草鱼中目前主要所研究的补体有C2、C3、C4、C6、C7和C9[49]。补体C3基因在感染大中华鳋（Sinergasilus major）的病鱼肝胰脏、脾脏中检测到大量的表达，鳃组织中检测到少量的表达[50]。经灭活后的柱状黄杆菌诱导发现，草鱼C9基因在1、7 d时在肝胰脏和脾脏中呈现显著上调[51-52]。通过研究不同条件下的肝脏原代细胞中草鱼C2基因[53]，发现其过表达能引起除部分补体因子外的各种下游组分表达量上调;而经过刺激过表达后的肝脏细胞中，其炎症因子等的表达量显著提高，被敲减C2基因的细胞则与之结果相反，表明C2基因在激活补体下游各项组分中起到重要的免疫作用，在各个组织中均呈现时间依赖性的表达模式。使用福尔马林灭活的嗜水气单胞菌诱导后，发现草鱼补体基因BF/C2A、BF/C2B、C6在血、脑、肌、中肾、肝胰脏、头肾、皮、脾、心、鳃、肠、鳍12个组织中均呈现表达量显著上调;C7基因仅在头肾、中肾、皮、脾、心脏和肠中进行了表达并显著上调;后续检测不同发育时期的补体基因mRNA表达量，发现补体C6在孵化1 d开始显著上升10 d后呈现下降趋势，表明补体C6在草鱼发育早期起着一定的免疫与机体保护功能[54]。卢明淼等在饲料中添加不同浓度的果寡糖，连续投喂草鱼56 d后发现2 g/kg剂量组的鱼体血清中补体C3和C4的活性显著高于对照组[56]。张涛在饲料中添加不同浓度的添加剂，连续投喂49 d后发现022%浓度酵母多糖组的鱼体血清中补体C3的活性与对照组相比均呈现出显著升高的趋势[57]。
　　6 主要组织相容性复合体及其相关因子
　　主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是一组高度多态的蛋白复合体，主要功能为递呈抗原，被T细胞所识别，从而激活机体的体液免疫和细胞免疫[58-59]。
　　草鱼MHC和哺乳动物MHC一样，分为参与内源性抗原呈递的Ⅰ型和参与外源性抗原呈递的Ⅱ型[60]。通常MHC-Ⅰ型类分子与CD8+细胞（cluster of differentiation 8+ cell）相互作用，只呈递内源蛋白;而MHC-Ⅱ类分子与CD4+细胞相互作用，只呈递外源蛋白[61]。
　　徐在言通过分析草鱼MHC类的多种相关多肽发现，其中一种不可溶性蛋白SIMP并通过研究其基因结构，确定草鱼SIMP基因不像人类SIMP基因具有组织表达的均一性，只在草鱼的脑组织中高表达，在脾脏中则低丰度表达[62]。苏建明等克隆了草鱼MHCⅡα基因，并检测到该基因主要在草鱼的脾脏、头肾、鳃、肠道等组织表达[63]。使用草鱼出血病疫苗处理幼龄草鱼后，在免疫后14 d内发现其中肾、肠道、脾脏中的MHCⅠ相对表达量均有所提高，推测可能是MHC因子参与了下游各类相关模式识别受体并进行了信号传递，引起了与对应信号通路免疫相关因子的转录[64-66]。
　　7 免疫球蛋白
　　免疫球蛋白（immunoglobulins）是鱼类主要的免疫因子之一，主要是IgM，有些鱼类中也存在IgI、IgZ、IgT、IgH等其他免疫球蛋白。目前草鱼中已经克隆IgM、IgZ和IgD 3种免疫球蛋白基因，并且制备出了相对应的抗体。邵建忠等经研究得出草鱼的体表黏液和肠道黏液中免疫球蛋白与血清中的免疫球蛋白种类相同[67]。江育林等通过研究推断，草鱼的免疫应答中可能具有一种含有较多二硫键的类似于IgM某些特性的大分子蛋白质，其在分离纯化过程中能分离成分子量近似于人IgG的较小分子，但当时没有获得明确的结果[68]。李亚南使用嗜水气单胞菌感染草鱼14 d后，定性分析血清中蛋白结构并对比凝聚后的聚合体进而推断，草鱼血液中的免疫球蛋白主要应该是IgM[69]。肖凡书等通过克隆草鱼含有IgM、IgZ和IgD重链ζ、δ、μ基因的基因座，发现了草鱼IgZ、IgZ-2和IgM-IgZ 3种不同的免疫球蛋白[70]。李青梅等使用GCRV攻毒草鱼后发现，72 h内中肾中IgM基因表达量在48～72 h内呈上调趋势[17]。张鹏英等使用GCRV疫苗腹腔注射健康草鱼，发现14 d内头肾、中肾、肠和脾脏中的IgM的相对表达量显著高于对照组[64]。 　　草鱼作为我国重要的四大家鱼之一，从20世纪50年代起，各种细菌病、病毒病已逐渐成为草鱼养殖业的“瓶颈”。至今为止，在病原检测、流行情况、诊断方法及防治方法上已经取得了一定的进展，但草鱼免疫因子及相关免疫应答分子机制方面的研究由于起步相对较晚，仍舊有大量的免疫相关因子未被了解，部分已经被研究的内容也仍旧须要进一步加强探究。从而根据各项疾病的症状及病理变化，结合生理生化指标、基因时空表达变化等试验数据，进一步确定草鱼免疫应答的关键基因，从而调动、开发草鱼自身的防御潜力，是有效防止病害发生、开展健康养殖、实现养殖业持续发展的重要战略之一。
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