泽泻炮制前后化学成分及其利尿作用研究
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作者:严桂杰 蓝梦柳 丘建芳 李小艳 许文 吴水生
摘要：目的 分析比較泽泻饮片麸炒、盐炙、土炒、酒炙炮制前后14种三萜类成分的含量，探讨泽泻及其不同炮制品的利尿作用。方法 采用超高液相色谱-质谱联用（UPLC-MS），色谱柱为Waters CORTECS UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，单四级杆质谱采用正离子SIR模式，测定泽泻生品和炮制品饮片中16-羰基-23-乙酰泽泻醇A、16-羰基-24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇L、24-乙酰泽泻醇F、泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B共14种三萜类成分的含量，探讨泽泻炮制过程中化学成分含量变化;采用水负荷大鼠代谢笼法，比较泽泻炮制前后的利尿作用。结果 经方法学验证，所建立UPLC-MS同时测定泽泻饮片中14种三萜类成分的方法符合分析要求。与生品比较，泽泻炮制品化学成分最主要的变化是泽泻三萜类24、25位环氧环发生开环转化，23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇C含量下降，而泽泻醇A类化合物含量升高，且盐炙泽泻的化学成分转化最为明显。动物实验结果显示：生品组和各炮制品组1 h尿量较空白对照组显著增加，且利尿效应酒炙品>土炒品>麸炒品>盐炙品>生品;生品组和盐炙品组2 h尿量与空白对照组比较差异无统计学意义，而酒炙品组、土炒品组、麸炒品组尿量较空白对照组显著增加，且利尿效应酒炙品>土炒品>麸炒品。结论 本研究建立的UPLC-MS测定泽泻生品及不同炮制品中化学成分含量方法准确、快速。泽泻炮制后化学成分发生明显变化，泽泻经酒炙、土炒和麸炒后较生品利尿作用显著增强。
关键词：泽泻;炮制;超高液相色谱-质谱联用;含量测定;利尿;大鼠
中图分类号：R283.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2020）04-0059-07
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906015
Study on Changes of Chemical Composition and Diuretic Effect in
Alismatis Rhizoma after Processing
YAN Guijie1，2， LAN Mengliu1， QIU Jianfang1， LI Xiaoyan1， XU Wen1，2， WU Shuisheng1，2
1. School of Pharmacy， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China; 2. Centre of Biomedical Research & Development， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China
Abstract： Objective To analyze the contents of 14 kinds of triterpenoids composition and diuretic effect of Alismatis Rhizoma before and after processing， including stir-frying with bran， stir-frying with salt-water， stir-frying with soil， and stir-frying with wine. Methods The UPLC-MS method was performed on a Waters CORTECS UPLC C18 column （2.1 mm × 100 mm， 1.6 μm） with a gradient elution using acetonitrile and water to quantitative analysis of the 14 triterpenoids （16-oxo-23-acetate-alisol A， 16-oxo-24-acetate-alisol A， alisol C， alisol F， alisol C 23-acetate， alisol L， alisol F 24-acetate， alisol A， alisol A 23-acetate， alisol A 24-acetate， alisol G， alisol B， alisol B 23-acetate， 11-deoxy-alisol B） of crude Alismatis Rhizoma and processed products. The method of metabolizable cage of rats was adopted to study the difference of diuretic effect of Alismatis Rhizoma before and after processing. Results Through methodological verification， the method of simultaneous determination of 14 triterpenoids in Alismatis Rhizoma by the established UPLC-MS met the analytical requirements. Compared with crude Alismatis Rhizoma， the most important processing change in the 14 triterpenoids of Alismatis Rhizoma was the ring-opening at 24， 25 epoxy rings in the triterpenoids. The contents of alisol B 23-acetate， alisol B， 11-deoxy alisol B and alisol C 23-acetate decreased， and the content of alisol A increased. The conversion was most significant in stir-frying with salt-water. The results of the rats experiment showed that compared with the control group， the urine output of crude and processed products of Alismatis Rhizoma significantly increased within 1 h， and the diuretic effect of Alismatis Rhizoma processed products， stir-frying with wine > stir-frying with soil > stir-frying with bran > stir-frying with salt-water > crude Alismatis Rhizoma; there was no statistical significance in urine output of crude and stir-frying with salt-water within 2 h， Alismatis Rhizoma processed products of stir-frying with wine， soil， and bran significantly increased compared with the control group， and the diuretic effect of stir-frying with wine > stir-frying with soil > stir-frying with bran. Conclusion The established UPLC-MS method is accurate and rapid for the determination the chemical composition of different processed products of Alismatis Rhizoma. The chemical composition of Alismatis Rhizoma processed products changes after the processing， and the diuretic effect of the stir-frying with wine， soil and bran of Alismatis Rhizoma increases. Keywords： Alismatis Rhizoma; processing; UPLC-MS; content determination; diuretic effect; rats
泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientale（Sam.）Juzep.的干燥块茎[1]，味甘，性寒，归肾、膀胱经，用于治疗水肿胀满、泄泻尿少、小便不利等。泽泻炮制方法较多，始载于南北朝《雷公炮炙论》“凡使不计多少，细锉，酒浸一宿，漉出，暴干任用也”;除酒炙外，《得配本草》记载泽泻“滋阴利水盐水炒”“健脾生用或酒炒用”“麸炒可缓和药性，长于渗湿和脾”，《本经逢原》有“利小便生用，入补剂盐、酒炒”等论述。可见，泽泻炮制方法主要有酒炙、盐炙、麸炒等，且不同炮制品的功效不同。
泽泻有利水渗湿功效，其炮制品利尿效应有所差异。如曾春晖等[2]采用代谢笼法和称重法研究显示，广西泽泻盐炙前后对正常小鼠尿量、肺和脑含水量均无显著影响，但能明显增加水肿模型小鼠尿量，减轻肺水肿程度。泽泻盐炙后化学成分发生改变可能是其炮制前后利尿作用差异的主要原因[3]。目前关于泽泻生品与多种炮制品利尿作用对比研究的报道较少。本研究以泽泻不同炮制品炮制前后14种化学成分的含量变化结合利尿效应评价，探讨泽泻炮制过程化学成分的转化及其利尿作用的变化，为泽泻的临床应用提供参考。
1 仪器、试药与动物
Waters SQD Ⅱ MS system（美国沃特世公司），Waters超高液相色谱仪（美国沃特世公司），大鼠代谢笼（意大利Tecniplast公司），RE-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），HH-S型水浴锅（郑州长城科工贸有限公司），YP202N分析天平（上海精密科学仪器有限公司）。
泽泻购于福建省建瓯市GAP产地，经福建中医药大学药用植物实验室范世明高级实验师鉴定为泽泻科泽泻属植物泽泻Alisma orientale（Sam.）Juzep.的干燥块茎，于福州回春药业GMP车间切片并制备不同炮制品。对照品16-羰基-24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇L、24-乙酰泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B，均为本实验室制备，经峰面积归一法测定纯度均大于98%;16-羰基-23-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇A因自制对照品不稳定，经校正因子计算后定量使用[4]。内标物甘草次酸（批号14082210，成都曼思特生物科技有限公司，纯度>99.10%），甲酸（色谱纯，美国ROE Scientific Inc），乙腈（色谱纯，德国默克公司），超纯水，氢氯噻嗪片（批号A170804，山西云鹏制药有限公司），吐温-80（批号20170320，天津市福晨化学试剂厂）。
清洁级雄性SD大鼠80只，体质量（200±20）g，上海斯莱克公司提供，动物合格证号SCXK（沪）2017-0005，饲养于SPF级环境，适应性喂养1周，自由进食饮水。
2 方法與结果
2.1 不同炮制品制备
盐炙品：200 g泽泻用26 mL盐水（4.0 g盐），闷润透，100 ℃炒制8 min[5];麸炒品：每200 g泽泻用30 g麦麸，200 ℃炒制3 min;酒炙品：每200 g泽泻用20 mL黄酒，闷润1 h，140 ℃炒制8 min;土炒品：每200 g泽泻用60 g黄土，210 ℃炒制1.5 min[6]。
2.2 大鼠灌胃液制备
取泽泻生品及盐炙品、麸炒品、酒炙品、土炒品各200 g，粉碎，过60目筛，加8倍量85%乙醇溶液，回流提取2次，每次2 h，冷却，过滤，减压浓缩至无醇味，用1%吐温-80配制成相当于原药材1.25 g/kg的药液，即得泽泻生品及不同炮制品的大鼠灌胃液。取氢氯噻嗪片，研磨成细粉，用1%吐温-80配制成0.005 g/kg的溶液，备用。
2.3 对照品溶液制备
称取14种对照品和内标物甘草次酸，精密称定，分别用乙腈制成16-羰基-23-乙酰泽泻醇A、16-羰基- 24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇C、泽泻醇F、泽泻醇L、泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇F浓度分别为0.430、0.442、1.490、1.125、1.304、0.332、0.254、0.324、0.525、1.352、1.360、2.248、0.435、1.060 mg/mL对照品贮备液及甘草次酸浓度为1.0 mg/mL的内标贮备液。分别吸取对照品贮备液适量，用乙腈稀释成混合对照品溶液及梯度浓度的对照品溶液，内标溶液浓度为500 ng/mL。
2.4 供试品溶液制备
取泽泻生品及不同炮制品各约1.0 g，精密称定，加入25 mL色谱乙腈于50 mL具塞三角瓶中，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷后补足减失的质量，10 000 r/min离心10 min，取上清液。取不同上清液各50 μL，分别加入950.0 μL内标溶液，涡旋1 min，0.22 μm微孔滤膜过滤后进样分析。
2.5 检测条件
色谱条件：色谱柱为Waters CORTECS UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.6 mm），流动相为水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，45%～85%B;5～6 min，85%～95%B;6～6.5 min，95%～95%B），流速0.30 mL/min，进样量1 μL，柱温45 ℃。 质谱条件：离子源为ESI源，检测方式为正离子检测（正离子模式响应强度优于负离子），扫描方式为SIR模式，对泽泻三萜类成分进行质谱调谐，因泽泻三萜单体均成加Na+分子离子峰，故选择[M+Na]+分子离子峰作为定量离子峰。其他参数：萃取因子Ex 2.00 V，RF系数0.1 V，去溶剂气流500 L/Hr，锥孔气流50 L/Hr，源温度150 ℃，去溶剂温度200 ℃，锥孔电压（cone）40 V。
数据采用Waters MassLynx 4.1软件进行分析。各待测物和内标物相关参数见表1，泽泻中14种成分UPLC图见图1。
2.6 方法学考察
2.6.1 线性关系考察
精密吸取各梯度浓度混合对照品溶液50 μL，分别加入950.0 μL内标物溶液，涡旋1 min，0.22 μm微孔滤膜过滤后进样分析，考察分析物和内标物的峰面积之比（Ai/As）与分析物浓度的线性关系，计算回归方程及相关系数。以信噪比（S/N）=3确定分析物的检测限（LOD），以S/N=10确定定量限（LOQ），结果见表2。
2.6.2 精密度试验
取“2.3”项下混合对照品溶液，按“2.5”项下色谱条件、质谱条件进行分析，1 d内平行进样6次，连续进样3 d，记录16-羰基-23-乙酰泽泻醇A、16-羰基-24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇L、24-乙酰泽泻醇F、泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的峰面积与内标的比值，计算日内精密度和日间精密度，结果见表3，表明仪器精密度良好。
2.6.3 重复性试验
精密称取同批次泽泻样品6份，按“2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.5”项下色谱、质谱条件进行分析，计算其含量及RSD，结果见表3，表明本试验建立的方法重复性良好。
2.6.4 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h进样分析，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性较好，见表3。
2.6.5 加样回收率试验
取同一批次泽泻供试品溶液，精密量取0.5 g，置50 mL三角瓶中，平行6份，分别精密加入近似1∶1含量的16-羰基-23-乙酰泽泻醇A、16-羰基-24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇L、泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的对照品贮备液，N2吹干溶剂，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.5”项下色谱、质谱条件进行分析，根据回归方程得含量，并计算平均回收率和RSD，结果见表4，表明本方法回收率良好。由于泽泻生品及其不同炮制品均未检出24-乙酰泽泻醇F，所以未进行该成分加样回收率试验。
2.7 样品测定
按上述方法，测定泽泻生品及炮制品中14种成分含量，结果见表5（其中24-乙酰泽泻醇F均未检出）。23-乙酰泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇C的炮制化学转化可能途径见图2。
2.8 泽泻及其炮制品对大鼠尿量的影响
大鼠禁食18 h后，按25 mL/kg灌胃超纯水，收集2 h尿量，尿量达灌服量40%以上者为合格动物。筛选出水负荷尿量合格的70只大鼠，按体质量随机分为空白对照组、氢氯噻嗪组、生品组、麸炒品组、盐炙品组、土炒品组、酒炙品组，每组10只。大鼠禁食不禁水18 h，按25 mL/kg灌胃超纯水，形成水负荷模型。30 min后挤压膀胱排尽余尿，给药组大鼠按20 mL/kg分别灌胃相应药液，空白对照组灌胃等量1%吐温-80，将大鼠立即置于代谢笼内，每隔1 h记录1次累积尿量，共记录2 h[7]。
与空白对照组比较，氢氯噻嗪组大鼠尿量明显增加（P<0.01），生品组及各炮制品组1 h尿量不同程度增加（P<0.05，P<0.01），利尿效应酒炙品>土炒品>麸炒品>盐炙品>生品;生品组和盐炙品组2 h尿量与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），而酒炙品组、土炒品组、麸炒品组尿量较空白对照组显著增加，利尿效应酒炙品>土炒品>麸炒品（P<0.05，P<0.01）。结果见表6。
3 讨论
生泽泻利水而不伤阴;盐泽泻能引药下行，可增强滋阴、利水作用[8]。泽泻炮制品的化学成分含量变化研究已有报道，曹柳等[9]采用HPLC研究清炒、麸炒、盐炙对泽泻中泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇B含量的影响，与生泽泻比较，清炒品中上述4种成分含量均降低，麸炒品均增加，盐炙品除23-乙酰泽泻醇B外均有所增加。韩伟健等[10]采用基于1H NMR的代谢组学方法分析了泽泻盐炙过程中的化学成分变化，并建立了追踪、识别中药复杂成分在炮制过程中变化的分析方法，结果表明泽泻生品饮片与盐炙品饮片成分差异较大，提示泽泻盐炙过程中原萜烷型泽泻醇类成分可能发生脱水、脱乙酰基和氧化反应。郑云枫等[11]发现，高温炮制过程中，泽泻药材中三萜类主成分23-乙酰泽泻醇B出现2条转变途径：一条是氧环开裂并重排生成24-乙酰泽泻醇A，进一步脱乙酰基转化成泽泻醇A;另一条是先脱乙酰基生成泽泻醇B，继而氧环开裂转化成泽泻醇A。这些研究为深入了解泽泻炮制过程中化学成分的转化提供了重要依据，但多数实验的检测指标有限，主要集中于23-乙酰泽泻醇B和泽泻醇A。
本研究表明，泽泻不同炮制品中的总三萜含量均有下降，其中泽泻醇L、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的含量与泽泻生品比较均有不同程度下降，而炮制品中16-羰基-23-乙酰泽泻醇A、16-羰基-24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇C、泽泻醇F、泽泻醇A、23-乙酰澤泻醇A、24-乙酰泽泻醇A的含量与泽泻生品比较均不同程度升高。结合14种三萜类成分的化学结构，含量下降的化合物多含有23、24环氧化结构，而其开环后的泽泻醇A类成分含量均升高，以2015年版《中华人民共和国药典》（一部）泽泻项下指标性成分23-乙酰泽泻醇B为例，无论生品还是炮制品中，该成分含量均最高，且炮制品中该成分含量均较生品有一定程度下降，可能产生了图3所示的转化，即23-乙酰泽泻醇B的23、24位环氧环开环裂解产生23-乙酰泽泻醇A和24-乙酰泽泻醇A，导致多数炮制品中23-乙酰泽泻醇A和24-乙酰泽泻醇A含量升高，同时由于23-乙酰泽泻醇A或24-乙酰泽泻醇A进一步脱乙酰基后产生泽泻醇A，故泽泻醇A也不同程度增加。 另外，23-乙酰泽泻醇B在炮制过程中脱乙酰基也可转化为泽泻醇B，泽泻醇B环氧开环则转化为泽泻醇A。从含量测定结果可以看出，盐炙泽泻23-乙酰泽泻醇B含量与生品比较差异有统计学意义，同时转化生成的泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇A和24-乙酰泽泻醇A含量也最高，泽泻醇B也大量转化为泽泻醇A。虽然其他炮制品23-乙酰泽泻醇B含量较生品无明显差异，但由于23-乙酰泽泻醇B含量非常高，其少量转化就会引起炮制品中泽泻醇A类成分含量增加，故炮制品中泽泻醇A类成分含量均较生品显著提高。
23-乙酰泽泻醇C是23-乙酰泽泻醇B母核16位加羰基的化合物，其与23-乙酰泽泻醇具有相同的23、24位环氧环结构。从含量测定结果来看，炮制品中16-羰基-23-乙酰泽泻醇A和16-羰基-24-乙酰泽泻醇A含量均明显高于生品，同样以盐炙泽泻最为明显。与23-乙酰泽泻醇B不同的是，23-乙酰泽泻醇C的降解炮制品与生品有明显差异，说明可能由于16位羰基的引入，使其炮制过程裂解开环或脱乙酰基转化更为容易，同时产生大量泽泻醇C，故不同炮制品中泽泻醇C的含量均较生品显著提高。另外，泽泻醇C可能通过23、24位环氧环开环裂解及16羰基与23位羟基的环合生成泽泻醇F，故泽泻炮制品中泽泻醇F含量均有显著提高。
泽泻中的泽泻醇L、11-去氧泽泻醇B可能同样发生23、24位开环，导致炮制后含量不同程度下降。泽泻醇G可能发生其他降解，从测定结果发现，其在生品中有少量存在，但炮制后除盐炙品外基本消失。本试验还同时测定了24-乙酰泽泻醇F，但所有生品和炮制品中均未检测到24-乙酰泽泻醇F，说明炮制过程中发生的脱乙酰基转化为单向转化的不可逆反应。另外，盐炙泽泻的14种三萜类成分总量与生品比较差异有统计学意义，另外几种炮制品也不同程度减少，说明除上述成分转化外，泽泻三萜在炮制过程中还存在其他转化途径或降解破坏。
泽泻生品及不同炮制品的利尿效应研究表明，与空白对照组比较，泽泻生品及炮制品在1 h内均有一定利尿作用，且炮制前后的利尿作用没有明显差异，酒炙品组、麸炒品组和土炒品组在2 h内的利尿作用均优于生品组，尤其酒炙品组的1、2 h利尿效果均最好，而从化学成分变化角度，酒炙泽泻与其他几种炮制品各三萜成分含量或总三萜含量并无明显差异，说明在酒炙过程中发生的成分转化所达到的组分间的配伍比例（内部构成比）可能较其他炮制过程更佳，从而导致其利尿效果最佳。在中药有效性研究中，除关注指标性成分含量外，其构成比也是药效表征的重要依据，因而对临床中药饮片的质量控制应建立整体质控模式。
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（收稿日期：2019-05-31）
（修回日期：2019-06-22;编辑：陈静）
基金项目：国家自然科学基金（81773956）
通讯作者：吴水生，E-mail：wushuishengwss@163.com
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